局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良基因表達(dá)的生物信息學(xué)及藥物分析

趙怡然，黎銀潮，陳樹達(dá)，佘穎芳，陳傲寒，周列民,2

局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良(focal cortical dysplasias，F(xiàn)CD)是皮質(zhì)發(fā)育畸形的一種類型，與藥物耐受性癲癇高度相關(guān)，是兒童新皮質(zhì)癲癇的最常見原因。Crome和Taylor等人最早描述此類疾病[1,2]。目前認(rèn)為對于FCD引起的頑固性癲癇的最佳治療手段是進(jìn)行外科手術(shù)，但是許多癲癇患者并不能在影像學(xué)檢查中發(fā)現(xiàn)小的病灶。

目前來說對于細(xì)微病灶的發(fā)現(xiàn)及FCD亞型的分類與診斷仍然有較大不足，因此，識別FCD相關(guān)的診斷治療及預(yù)后指標(biāo)，如生物標(biāo)志物具有重要作用。在這項(xiàng)研究中，我們通過生物信息學(xué)分析的方法，發(fā)現(xiàn)局灶性腦皮質(zhì)發(fā)育不良的潛在致病基因及疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號通路途徑，從分子水平揭示FCD潛在的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 基因芯片來源 基因芯片數(shù)據(jù)集GSE62019及相關(guān)臨床資料來自于GEO數(shù)據(jù)庫，其采用的是商業(yè)化的離子通道芯片平臺GPL10558[3]。含有5例局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良患者的腦組織標(biāo)本，對照組包括3例正常的腦組織標(biāo)本。

1.2 數(shù)據(jù)的預(yù)處理與差異表達(dá)基因的篩選 基于GPL10558平臺構(gòu)建的信息，將探針識別號轉(zhuǎn)化為正式的基因名稱。然后，利用limma軟件包分析基因表達(dá)矩陣，經(jīng)affy、affyPLM軟件包進(jìn)一步處理，得到差異表達(dá)基因(DEGs)，利用Benjamini-Hochberg錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率方法，調(diào)整P值來降低假陽性率[4～7]。采用調(diào)整P值≤0.05，|logFC|≥2 作為截?cái)嘀档臉?biāo)準(zhǔn)，logFC≥2和logFC≤-2分別對應(yīng)上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因。

1.3 差異表達(dá)基因本體論(Gene ontology,Go)和信號通路富集分析 GO分析是對基因產(chǎn)物及其功能特征進(jìn)行注釋，能夠有效地用于鑒定高通量遺傳數(shù)據(jù)特征的生物學(xué)屬性，包括分子功能(molecular function，MF)、生物學(xué)過程(biological processes，BP)和細(xì)胞組分(cellular components，CC)[8]。KEGG數(shù)據(jù)庫是一個(gè)處理基因組、細(xì)胞、疾病和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等的高通量生物數(shù)據(jù)庫的集合，通常用于注釋參與其中的基因列表和信號通路網(wǎng)絡(luò)[9]。利用功DAVID數(shù)據(jù)庫對DEGs進(jìn)行GO分析和KEGG/生物途徑富集分析，使用ggplot2包將共表達(dá)的DEGs的功能分析，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.05具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[10]。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-Protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)分析 STRING數(shù)據(jù)庫(The Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，version 11.0)用于搜索蛋白質(zhì)之間的直接(物理)和間接(功能)關(guān)聯(lián)，評估蛋白質(zhì)之間的相互作用[11]。將界值標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為置信度得分≥0.4且最大相互作用數(shù)=0。隨后，用Cytoscape的插件Cytohubba分析PPI網(wǎng)絡(luò),使用MCC算法，從PPI網(wǎng)絡(luò)中挑選出與周圍基因具有高度連通性前5個(gè)基因，作為核心基因[12]。

1.5 差異表達(dá)基因功能模塊分析 使用Cytoscape中的MCODE插件，其根據(jù)拓?fù)潢P(guān)系對給定網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類，本研究分析基于DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)以篩選出基因功能模塊，degree cutoff=2，node score cutoff=0.2，k-core=2，and max depth=100。另外篩選出的功能模塊映射到STRING，進(jìn)行GO和KEGG分析以注釋。

1.6 藥物-基因的相互作用 探究基因與現(xiàn)有藥物之間的相互作用以及探索新藥適應(yīng)證在FCD中的潛在應(yīng)用。 利用開源的藥物基因相互作用數(shù)據(jù)庫(DGIdb：https：//www.dgidb.org)[13]。以核心基因作為潛在的靶標(biāo)在數(shù)據(jù)庫中搜索現(xiàn)有藥物或化合物。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)進(jìn)行DEGs的篩選與鑒定;采用Fisher精確檢驗(yàn)分析GO和KEGG注釋富集。所有統(tǒng)計(jì)分析均在R版本3.6.3軟件中執(zhí)行。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)基因 通過GSE62019進(jìn)行差異基因篩選出777個(gè)DEGs，分別包括364下調(diào)基因和413個(gè)上調(diào)基因。

2.2 差異表達(dá)基因的功能分析 為了進(jìn)一步了解777個(gè)DEGs的生物學(xué)功能，分別將413個(gè)上調(diào)基因和364下調(diào)基因進(jìn)行GO和KEGG/生物途徑富集分析。GO分析結(jié)果顯示，413個(gè)上調(diào)DEGs的細(xì)胞組分在細(xì)胞外間隙和胞外區(qū)中富集；生物過程主要是組成細(xì)胞外基質(zhì)和膠原纖維組織，參與免疫應(yīng)答；分子功能富集在細(xì)胞因子活性、生長因子活性以及鈣離子結(jié)合。KEGG/生物途徑分析顯示，上調(diào)的DEGs主要參與PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，補(bǔ)體途徑和抗原加工提呈過程(見圖1)。364下調(diào)基因DEGs的細(xì)胞組分在細(xì)胞外間隙和胞外區(qū)中富集，與上調(diào)基因相同；生物過程主要是細(xì)胞趨化性，T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)增殖的調(diào)節(jié)以及參與免疫應(yīng)答；分子功能富集在轉(zhuǎn)運(yùn)活性，單加氧酶活性和補(bǔ)體受體活性。KEGG/生物途徑分析顯示，上調(diào)的DEGs主要參與細(xì)胞因子受體互作，產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)和類固醇激素合成途徑(見圖2)。

圖1 上調(diào)DEGs的GO分析及KEGG分析

2.3 核心基因的功能模塊及表達(dá)水平分析

2.3.1 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及5個(gè)核心基因的篩選 為了鑒定潛在調(diào)控基因，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，再用Cytoscape插件Cytohubb計(jì)算PPI網(wǎng)絡(luò)，然后按MCC方法選擇靠前的5個(gè)基因，包括，將這5個(gè)基因命名為核心基因(見圖3)。

2.3.2 功能模塊分析 通過Cytoscape軟件中的MCODE插件及DVAID在線網(wǎng)站分析DEGs的功能模塊，其基于基因計(jì)數(shù)對其進(jìn)行降序排序P值<0.05(見表1)。顯示核心功能模塊的27個(gè)DEGs主要富集在細(xì)胞間隙中，其涉及的生物學(xué)過程集中在細(xì)胞趨化活性和炎癥反應(yīng)，生物分子功能分析顯示集中在趨化因子活性，G蛋白偶聯(lián)受體活性和CXCR趨化因子受體結(jié)合，KEGG信號通路分析核心模塊的DEGs主要參與趨化因子信號通路和神經(jīng)信號傳遞信號通路。與平行對照的腦組織相比，這些基因的表達(dá)改變，顯示了探究差異表達(dá)基因的相關(guān)生物學(xué)功能及信號通路對FCD的發(fā)病機(jī)制具有重要價(jià)值。

2.4 藥物基因的相互作用 篩選出的5個(gè)核心基因進(jìn)行藥物-基因相互作用分析。我們發(fā)現(xiàn)多種藥物靶向核心基因，具體(見表2)。

表1 DEGs的功能模塊相關(guān)分析

表2 基因-藥物分析結(jié)果

3 討 論

局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良是由于大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的增殖異常或者異性障礙引起，其結(jié)果常常會導(dǎo)致難治性癲癇的發(fā)生。對于FCD的治療，外科手術(shù)被證實(shí)是較為有效的方法，有研究表明在FCD引起的難治性癲癇患者中，外科手術(shù)治療后的癲癇緩解率可達(dá)到50%～80%[14]。然而對于FCD的診斷，目前的影像學(xué)相關(guān)檢查并不能完全發(fā)現(xiàn)所有的FCD病灶，而且多數(shù)的FCD患者在頭部MRI及其他功能性影像學(xué)檢查并不能發(fā)現(xiàn)異常。因此識別局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良相關(guān)的生物標(biāo)志物對于其疾病的診斷、治療選擇及預(yù)后具有重要作用，進(jìn)而探討FCD的發(fā)病機(jī)制并進(jìn)行藥物靶點(diǎn)的篩選。越來越多的研究報(bào)道FCD與基因突變相關(guān)，如PI3K-AKT3-TSC信號通路、mTOR信號通路及PTKs信號通路相關(guān)的基因[15]。在這項(xiàng)研究中，我們選擇患者手術(shù)切除的大腦組織標(biāo)本，通過生物信息學(xué)分析的方法，發(fā)現(xiàn)局灶性腦皮質(zhì)發(fā)育不良的潛在致病基因，如C3、SAA1、ANXA1、CXCL2和CCL25，及其相關(guān)的現(xiàn)有靶向藥物和參與FCD發(fā)病相關(guān)的信號通路。

我們發(fā)現(xiàn)的潛在的致病基因中，膜聯(lián)蛋白A1(Annexin A1，ANXA1)能夠促進(jìn)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重排，細(xì)胞極化和細(xì)胞遷移[16]。通過激活甲酰基肽受體促進(jìn)粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的趨化性以及通過增強(qiáng)由T細(xì)胞活化觸發(fā)的信號級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)活化T細(xì)胞的分化和增殖來促進(jìn)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[16]。補(bǔ)體成分3(complement component 3，C3)在補(bǔ)體系統(tǒng)的激活中起核心作用，C3轉(zhuǎn)化酶對其的加工是經(jīng)典途徑和替代途徑中的中心反應(yīng)。在慢性炎癥中，C3充當(dāng)嗜中性粒細(xì)胞的趨化因子，誘導(dǎo)平滑肌收縮，增加血管通透性，并導(dǎo)致組胺從肥大細(xì)胞和嗜堿性白細(xì)胞釋放[17]。血清淀粉樣蛋白A-1蛋白(Serum amyloid A-1 protein，SAA1)屬于SAA家族，是主要的急性期蛋白。在正常血清中濃度較低，但在老年人和淀粉樣變患者血清中濃度較高它是淀粉樣蛋白A的循環(huán)前體，主要沉積在AA型淀粉樣原纖維中[18]。C-X-C模體趨化因子 2(C-X-C motif chemokine ligand 2，CXCL2)是由活化的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的血液調(diào)節(jié)趨化因子，在炎癥部位表達(dá)，在體外能夠抑制造血祖細(xì)胞增殖[19]。C-C模體趨化因子配體25(C-C motif chemokine ligand 25，CCL25)可能參與T細(xì)胞的發(fā)育，對胸腺細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、THP-1細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞有趨化活性，但對外周血淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞無趨化活性，與非典型趨化因子受體ACKR4結(jié)合并介導(dǎo)β-arrestin(ARRB1/2)向ACKR4募集[20]。

基于上述的基因功能分析，我們發(fā)現(xiàn)這些基因與炎癥過程和免疫應(yīng)答密切相關(guān)。有許多的研究證實(shí)許多促炎細(xì)胞因子參與了癲癇的病理生理，特別是在局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良的患者中[21]。既往有研究在局灶性發(fā)育不良的患者中發(fā)現(xiàn)IL-17、TNF-α等炎性因子的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)伴有小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活[22]。ANXA1廣泛表達(dá)于許多組織中，包括白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。ANXA1存在于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜上，但也可以通過自分泌和旁分泌的方式分泌到循環(huán)中。有許多的文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)體受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)，指出這些蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和發(fā)育中潛在的作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的幾乎所有細(xì)胞類型(即神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞)上都鑒定出了補(bǔ)體受體[23]。有研究表明補(bǔ)體相關(guān)蛋白在出生后大腦的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中廣泛表達(dá)，其級聯(lián)反應(yīng)在突觸的發(fā)育重塑及突觸回路的形成過程中起到了重要作用[24]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，補(bǔ)體蛋白由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞局部合成，其中小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)補(bǔ)體的主要產(chǎn)生者。此外，一種活化的C3片段的受體CR2(CD21)，也在神經(jīng)祖細(xì)胞中表達(dá)，并調(diào)節(jié)成年海馬神經(jīng)發(fā)生[25]。由神經(jīng)膠質(zhì)及其受體分泌的趨化因子參與大腦發(fā)育過程中的神經(jīng)元遷移和細(xì)胞增殖，突觸活性調(diào)節(jié)和神經(jīng)內(nèi)分泌功能的調(diào)節(jié)[26]。趨化因子可以直接影響神經(jīng)元的興奮性，有研究報(bào)道趨化因子CCL2、CCL3、CCL5和CX3CL1在癲癇中具有重要作用[27]。另外有研究報(bào)道CCL2改變小腦神經(jīng)元的電生理特性和參與Ca2+信號傳導(dǎo)通路，降低脊髓神經(jīng)元的抑制性反應(yīng)，并通過激活p38 MAP激酶途徑在體外增強(qiáng)海馬旁側(cè)支通路的興奮性突觸后電流[28]。有文獻(xiàn)報(bào)道在FCD患者中細(xì)胞因子/趨化因子及其受體的異常表達(dá)，并證實(shí)了多種炎癥介質(zhì)(IL1β、IL1Ra、IL6、IL10、CCL3、CCL4、TNFα和VEGF)在FCD患者中的異常表達(dá)[29]。因此我們認(rèn)為這5個(gè)預(yù)測關(guān)鍵基因與FCD的發(fā)病機(jī)制具有密切聯(lián)系。一方面，這些研究使我們有理由相信它們可以作為FCD的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的研究；另一方面，我們推測FCD是一種系統(tǒng)性疾病，是在大腦的一種局部表現(xiàn)。另外這些研究提示我們預(yù)測的靶向藥物(大多為免疫炎癥抑制劑)可能在治療FCD中具有潛在的作用。到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)所有這些基因和藥物在FCD的研究和應(yīng)用中。雖然我們通過生物信息學(xué)分析識別5個(gè)基因和多個(gè)基因現(xiàn)有的靶向藥物，但需要進(jìn)行分子實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。更重要的是本文為我們提供探索FCD分子機(jī)制的線索。

4 結(jié) 論

我們通過應(yīng)用一系列生物信息學(xué)方法對基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，篩選出5個(gè)潛在的基因標(biāo)志物和多種現(xiàn)有靶向藥物，這將為我們了解新的研究靶點(diǎn)和新的藥物適應(yīng)證提供依據(jù)。