局灶性皮質發育不良基因表達的生物信息學及藥物分析

趙怡然，黎銀潮，陳樹達，佘穎芳，陳傲寒，周列民,2

局灶性皮質發育不良(focal cortical dysplasias，FCD)是皮質發育畸形的一種類型，與藥物耐受性癲癇高度相關，是兒童新皮質癲癇的最常見原因。Crome和Taylor等人最早描述此類疾病[1,2]。目前認為對于FCD引起的頑固性癲癇的最佳治療手段是進行外科手術，但是許多癲癇患者并不能在影像學檢查中發現小的病灶。

目前來說對于細微病灶的發現及FCD亞型的分類與診斷仍然有較大不足，因此，識別FCD相關的診斷治療及預后指標，如生物標志物具有重要作用。在這項研究中，我們通過生物信息學分析的方法，發現局灶性腦皮質發育不良的潛在致病基因及疾病發生發展相關的信號通路途徑，從分子水平揭示FCD潛在的分子機制。

1 材料和方法

1.1 基因芯片來源 基因芯片數據集GSE62019及相關臨床資料來自于GEO數據庫，其采用的是商業化的離子通道芯片平臺GPL10558[3]。含有5例局灶性皮質發育不良患者的腦組織標本，對照組包括3例正常的腦組織標本。

1.2 數據的預處理與差異表達基因的篩選 基于GPL10558平臺構建的信息，將探針識別號轉化為正式的基因名稱。然后，利用limma軟件包分析基因表達矩陣，經affy、affyPLM軟件包進一步處理，得到差異表達基因(DEGs)，利用Benjamini-Hochberg錯誤發現率方法，調整P值來降低假陽性率[4～7]。采用調整P值≤0.05，|logFC|≥2 作為截斷值的標準，logFC≥2和logFC≤-2分別對應上調和下調的差異表達基因。

1.3 差異表達基因本體論(Gene ontology,Go)和信號通路富集分析 GO分析是對基因產物及其功能特征進行注釋，能夠有效地用于鑒定高通量遺傳數據特征的生物學屬性，包括分子功能(molecular function，MF)、生物學過程(biological processes，BP)和細胞組分(cellular components，CC)[8]。KEGG數據庫是一個處理基因組、細胞、疾病和信號轉導通路等的高通量生物數據庫的集合，通常用于注釋參與其中的基因列表和信號通路網絡[9]。利用功DAVID數據庫對DEGs進行GO分析和KEGG/生物途徑富集分析，使用ggplot2包將共表達的DEGs的功能分析，錯誤發現率(false discovery rate，FDR)<0.05具有顯著的統計學意義[10]。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-Protein interaction，PPI)網絡分析 STRING數據庫(The Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，version 11.0)用于搜索蛋白質之間的直接(物理)和間接(功能)關聯，評估蛋白質之間的相互作用[11]。將界值標準設定為置信度得分≥0.4且最大相互作用數=0。隨后，用Cytoscape的插件Cytohubba分析PPI網絡,使用MCC算法，從PPI網絡中挑選出與周圍基因具有高度連通性前5個基因，作為核心基因[12]。

1.5 差異表達基因功能模塊分析 使用Cytoscape中的MCODE插件，其根據拓撲關系對給定網絡進行聚類，本研究分析基于DEGs的PPI網絡以篩選出基因功能模塊，degree cutoff=2，node score cutoff=0.2，k-core=2，and max depth=100。另外篩選出的功能模塊映射到STRING，進行GO和KEGG分析以注釋。

1.6 藥物-基因的相互作用 探究基因與現有藥物之間的相互作用以及探索新藥適應證在FCD中的潛在應用。 利用開源的藥物基因相互作用數據庫(DGIdb：https：//www.dgidb.org)[13]。以核心基因作為潛在的靶標在數據庫中搜索現有藥物或化合物。

1.7 統計學分析 統計分析采用t檢驗進行DEGs的篩選與鑒定;采用Fisher精確檢驗分析GO和KEGG注釋富集。所有統計分析均在R版本3.6.3軟件中執行。

2 結 果

2.1 差異表達基因 通過GSE62019進行差異基因篩選出777個DEGs，分別包括364下調基因和413個上調基因。

2.2 差異表達基因的功能分析 為了進一步了解777個DEGs的生物學功能，分別將413個上調基因和364下調基因進行GO和KEGG/生物途徑富集分析。GO分析結果顯示，413個上調DEGs的細胞組分在細胞外間隙和胞外區中富集；生物過程主要是組成細胞外基質和膠原纖維組織，參與免疫應答；分子功能富集在細胞因子活性、生長因子活性以及鈣離子結合。KEGG/生物途徑分析顯示，上調的DEGs主要參與PI3K-Akt信號轉導通路，補體途徑和抗原加工提呈過程(見圖1)。364下調基因DEGs的細胞組分在細胞外間隙和胞外區中富集，與上調基因相同；生物過程主要是細胞趨化性，T細胞穩態增殖的調節以及參與免疫應答；分子功能富集在轉運活性，單加氧酶活性和補體受體活性。KEGG/生物途徑分析顯示，上調的DEGs主要參與細胞因子受體互作，產生IgA的腸道免疫網絡和類固醇激素合成途徑(見圖2)。

圖1 上調DEGs的GO分析及KEGG分析

2.3 核心基因的功能模塊及表達水平分析

2.3.1 PPI 網絡的構建及5個核心基因的篩選 為了鑒定潛在調控基因，構建PPI網絡，再用Cytoscape插件Cytohubb計算PPI網絡，然后按MCC方法選擇靠前的5個基因，包括，將這5個基因命名為核心基因(見圖3)。

2.3.2 功能模塊分析 通過Cytoscape軟件中的MCODE插件及DVAID在線網站分析DEGs的功能模塊，其基于基因計數對其進行降序排序P值<0.05(見表1)。顯示核心功能模塊的27個DEGs主要富集在細胞間隙中，其涉及的生物學過程集中在細胞趨化活性和炎癥反應，生物分子功能分析顯示集中在趨化因子活性，G蛋白偶聯受體活性和CXCR趨化因子受體結合，KEGG信號通路分析核心模塊的DEGs主要參與趨化因子信號通路和神經信號傳遞信號通路。與平行對照的腦組織相比，這些基因的表達改變，顯示了探究差異表達基因的相關生物學功能及信號通路對FCD的發病機制具有重要價值。

2.4 藥物基因的相互作用 篩選出的5個核心基因進行藥物-基因相互作用分析。我們發現多種藥物靶向核心基因，具體(見表2)。

表1 DEGs的功能模塊相關分析

表2 基因-藥物分析結果

3 討 論

局灶性皮質發育不良是由于大腦皮質神經元細胞的增殖異常或者異性障礙引起，其結果常常會導致難治性癲癇的發生。對于FCD的治療，外科手術被證實是較為有效的方法，有研究表明在FCD引起的難治性癲癇患者中，外科手術治療后的癲癇緩解率可達到50%～80%[14]。然而對于FCD的診斷，目前的影像學相關檢查并不能完全發現所有的FCD病灶，而且多數的FCD患者在頭部MRI及其他功能性影像學檢查并不能發現異常。因此識別局灶性皮質發育不良相關的生物標志物對于其疾病的診斷、治療選擇及預后具有重要作用，進而探討FCD的發病機制并進行藥物靶點的篩選。越來越多的研究報道FCD與基因突變相關，如PI3K-AKT3-TSC信號通路、mTOR信號通路及PTKs信號通路相關的基因[15]。在這項研究中，我們選擇患者手術切除的大腦組織標本，通過生物信息學分析的方法，發現局灶性腦皮質發育不良的潛在致病基因，如C3、SAA1、ANXA1、CXCL2和CCL25，及其相關的現有靶向藥物和參與FCD發病相關的信號通路。

我們發現的潛在的致病基因中，膜聯蛋白A1(Annexin A1，ANXA1)能夠促進肌動蛋白細胞骨架的重排，細胞極化和細胞遷移[16]。通過激活甲酰基肽受體促進粒細胞和單核細胞的趨化性以及通過增強由T細胞活化觸發的信號級聯反應，調節活化T細胞的分化和增殖來促進適應性免疫應答[16]。補體成分3(complement component 3，C3)在補體系統的激活中起核心作用，C3轉化酶對其的加工是經典途徑和替代途徑中的中心反應。在慢性炎癥中，C3充當嗜中性粒細胞的趨化因子，誘導平滑肌收縮，增加血管通透性，并導致組胺從肥大細胞和嗜堿性白細胞釋放[17]。血清淀粉樣蛋白A-1蛋白(Serum amyloid A-1 protein，SAA1)屬于SAA家族，是主要的急性期蛋白。在正常血清中濃度較低，但在老年人和淀粉樣變患者血清中濃度較高它是淀粉樣蛋白A的循環前體，主要沉積在AA型淀粉樣原纖維中[18]。C-X-C模體趨化因子 2(C-X-C motif chemokine ligand 2，CXCL2)是由活化的單核細胞和中性粒細胞產生的血液調節趨化因子，在炎癥部位表達，在體外能夠抑制造血祖細胞增殖[19]。C-C模體趨化因子配體25(C-C motif chemokine ligand 25，CCL25)可能參與T細胞的發育，對胸腺細胞、巨噬細胞、THP-1細胞和樹突狀細胞有趨化活性，但對外周血淋巴細胞和中性粒細胞無趨化活性，與非典型趨化因子受體ACKR4結合并介導β-arrestin(ARRB1/2)向ACKR4募集[20]。

基于上述的基因功能分析，我們發現這些基因與炎癥過程和免疫應答密切相關。有許多的研究證實許多促炎細胞因子參與了癲癇的病理生理，特別是在局灶性皮質發育不良的患者中[21]。既往有研究在局灶性發育不良的患者中發現IL-17、TNF-α等炎性因子的表達上調，同時伴有小膠質細胞和星形膠質細胞的激活[22]。ANXA1廣泛表達于許多組織中，包括白細胞、淋巴細胞、上皮細胞和內皮細胞。ANXA1存在于細胞內和細胞膜上，但也可以通過自分泌和旁分泌的方式分泌到循環中。有許多的文獻報道補體受體在中樞神經系統中的表達，指出這些蛋白在中樞神經系統穩態和發育中潛在的作用。在中樞神經系統的幾乎所有細胞類型(即神經元、小膠質細胞和星形膠質細胞)上都鑒定出了補體受體[23]。有研究表明補體相關蛋白在出生后大腦的神經元和膠質細胞中廣泛表達，其級聯反應在突觸的發育重塑及突觸回路的形成過程中起到了重要作用[24]。在中樞神經系統中，補體蛋白由神經元和神經膠質細胞局部合成，其中小膠質細胞和星形膠質細胞是中樞神經系統補體的主要產生者。此外，一種活化的C3片段的受體CR2(CD21)，也在神經祖細胞中表達，并調節成年海馬神經發生[25]。由神經膠質及其受體分泌的趨化因子參與大腦發育過程中的神經元遷移和細胞增殖，突觸活性調節和神經內分泌功能的調節[26]。趨化因子可以直接影響神經元的興奮性，有研究報道趨化因子CCL2、CCL3、CCL5和CX3CL1在癲癇中具有重要作用[27]。另外有研究報道CCL2改變小腦神經元的電生理特性和參與Ca2+信號傳導通路，降低脊髓神經元的抑制性反應，并通過激活p38 MAP激酶途徑在體外增強海馬旁側支通路的興奮性突觸后電流[28]。有文獻報道在FCD患者中細胞因子/趨化因子及其受體的異常表達，并證實了多種炎癥介質(IL1β、IL1Ra、IL6、IL10、CCL3、CCL4、TNFα和VEGF)在FCD患者中的異常表達[29]。因此我們認為這5個預測關鍵基因與FCD的發病機制具有密切聯系。一方面，這些研究使我們有理由相信它們可以作為FCD的潛在靶點進行進一步的研究；另一方面，我們推測FCD是一種系統性疾病，是在大腦的一種局部表現。另外這些研究提示我們預測的靶向藥物(大多為免疫炎癥抑制劑)可能在治療FCD中具有潛在的作用。到目前為止，尚未發現所有這些基因和藥物在FCD的研究和應用中。雖然我們通過生物信息學分析識別5個基因和多個基因現有的靶向藥物，但需要進行分子實驗驗證。更重要的是本文為我們提供探索FCD分子機制的線索。

4 結 論

我們通過應用一系列生物信息學方法對基因表達譜進行分析，篩選出5個潛在的基因標志物和多種現有靶向藥物，這將為我們了解新的研究靶點和新的藥物適應證提供依據。