放線菌篩選及降解光氧化褐煤工藝條件研究

2020-12-21 10:39:12李建濤劉向榮莊肅凱

潔凈煤技術 2020年6期

李建濤，劉向榮，石晨，莊肅凱

(1.商洛學院化學工程與現代材料學院，陜西商洛 726000；2.陜西省尾礦綜合利用重點實驗室，陜西商洛 726000；3.西安科技大學化學與化工學院，陜西西安 710054)

0 引言

煤的微生物降解是繼煤液化、氣化之后的新技術，是具有發展前景的低階煤清潔高效利用的途徑之一[1-3]。煤的微生物降解(或稱微生物溶煤，煤的微生物轉化)指利用真菌、細菌和放線菌等微生物作用來實現煤的溶解、降解、液化或氣化，以獲取清潔燃料和其他化學品[4-5]。20世紀80年代，Fakoussa R M[6]和Cohen M S[7]研究表明假單胞菌和白腐菌能夠降解煤。經過近40年的發展，煤的微生物轉化技術取得了較大成果，但也存在很多難題，如：微生物對煤的降解率低、缺乏高效降解菌、煤的預處理方式有待改進、降解產物難以分離、高附加值利用途徑少、降解機理不明等，在一定程度上阻礙了煤微生物降解技術的工業化進程。其中，微生物對煤的降解率低、高效降解菌缺乏是最基本的問題[8-10]。袁紅莉等[11]經研究發現，自然界褐煤在風化降解過程中，不同時期微生物類群存在明顯的演替現象，即放線菌為褐煤風化初期的主要作用菌，隨之是細菌，真菌在褐煤風化后期起主要作用。可見，煤的微生物降解是分步進行的，多種菌在不同階段起不同作用的協同過程。

本文設想建立煤的微生物分級降解方法，以實現微生物對煤的協同作用和高效降解。首先篩選出能夠降解低階煤的放線菌菌株，并利用單因素方法研究降解條件，為低階煤分級降解方法的建立提供支撐。

1 試驗

1.1 煤樣及預處理

試驗用煤樣為內蒙勝利褐煤(SLH)、云南昭通褐煤(ZTH)、山西渾源褐煤(HYH)和內蒙元寶山褐煤(YBH)，各煤樣在60 ℃下烘干3 h，經破碎、粉磨、篩分得到粒度為0.150～0.075 mm 的煤樣。由于微生物對原煤的降解效果較差，因此在降解前需現對原煤進行預處理，以提高煤的含氧量，從而提高煤的微生物可降解性。本文利用自行設計加工的旋轉床光化學反應器[12]分別對各煤樣進行光氧化預處理，預處理最佳條件為：加煤量20 g，煤樣粒度0.150～0.075 mm，紫外光強度150 W，馬達轉速120 r/min，氧化時間42 h，通氧時間40 min，得到光氧化后的煤樣，分別記為GSLH、GZTH、GHYH和GYBH。光氧化褐煤的工業分析和元素分析結果見表1。對各光氧化煤樣進行低溫氮吸附檢測，GSLH、GZTH、GHYH和GYBH的比表面積分別為4.156 8、3.636 3、3.399 3、3.796 9 m2/g。

表1 煤樣的工業分析和元素分析

1.2 菌株及復壯

1)菌株及培養基

試驗用5株放線菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC，表2)，培養基為高氏一號培養基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，固體培養基加瓊脂15 g，蒸餾水 1 000 mL，pH=7.4～7.6。

表2 試驗菌種

2)菌株活化及復壯

將4 ℃甘油保藏的放線菌(黃微綠鏈霉菌(SF)、綠孢鏈霉菌(SV)、奇跡絲束放線菌(AM)、細黃鏈霉菌(SM)和菲律賓擬孢囊菌(KP))分別接種至裝有10 mL高氏一號液體培養基的試管中，將試管放入恒溫振蕩培養箱，在28 ℃、振蕩頻率160 r/min條件下培養4 d；然后在預先倒好的高氏一號培養基平板上分別劃線，倒置于人工氣候培養箱，在28 ℃、相對濕度80%條件下培養4 d，觀察無雜菌后，分別用接種針挑少量菌體放入50 mL無菌水中充分振蕩，用接種環蘸取一孔接種于裝有10 mL高氏一號培養基的試管中，將試管放入恒溫振蕩培養箱，在28 ℃、振蕩頻率160 r/min條件下培養4 d后，用接種環蘸取一孔接種至裝有100 mL高氏一號培養基的250 mL錐形瓶中，置于恒溫振蕩培養箱，相同條件培養4 d，得到5種放線菌菌液作為篩選試驗母菌液。

1.3 菌-煤匹配篩選試驗

取試管若干，每個試管中裝高氏一號液體培養基20 mL，分別做無菌的空白對照試驗和5種放線菌對4種光氧化褐煤的降解試驗。除空白以外的試管，分別用接種環蘸取復壯好的5種放線菌一孔接種，放入恒溫振蕩培養箱，溫度28 ℃，振蕩頻率160 r/min，培養4 d，接種的培養基變渾濁。試管分別加(0.16±0.000 2)g、粒度為0.150～0.075 mm的煤樣，放入恒溫培養箱，繼續振蕩培養20 d，每個試驗設置3組平行試驗。試驗結束后，3組平行試驗的降解產物分別離心(10 000 r/min，10 min)，上清液過濾，濾液過0.22 μm微孔濾膜，以去離子水為參比，利用TU-1900型紫外-可見分光光度計檢測濾液在450 nm處的吸光度，求得3組平行試驗的A450平均值，作為指標。比較5種放線菌對光氧化褐煤降解液吸光度，A450最大者為優勢菌株。

煤樣經微生物降解后，液體中含有煤降解產物而呈黑色，其對光束存在一定的散射和吸收作用，因此，利用紫外-可見分光光度計測定黑色降解液在波長為450 nm處的吸光度A450，并以此作為降解效果指標，對微生物降解煤的效果進行評價。通過降解液的A450值來判斷微生物降解煤的效果是基于大量的紫外連續掃描數據及統計方法得到，而不是煤炭微生物降解所得液體產物的特征吸收波長[13-15]。

1.4 單因素試驗設計

影響微生物液體降解煤效果的因素繁多，其中最重要的影響因素有煤種、菌種、煤樣預處理方式、加煤量、煤樣粒度、接種量、培養基、培養時間(降解時間)、培養溫度(降解溫度)和培養箱振蕩頻率等。選用GSLH，煤樣預處理方式采用光氧化預處理。菌種為1.3篩選的優勢放線菌，培養基為高氏一號培養基，煤樣粒度為光氧化預處理過程確定的最佳粒度(0.150～0.075 mm)，培養溫度為CGMCC提供的該微生物生長的最適宜溫度28 ℃，對加煤量、接種量、培養時間和振蕩頻率4個條件進行探討，確定最佳值。

1)加煤量的確定

分別稱取0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 g GSLH煤樣，稱準至0.000 2 g，煤樣粒度0.150～0.075 mm，液體培養基20 mL接種SV母菌液2.0 mL，培養箱溫度28 ℃，振蕩頻率為160 r/min，培養14 d，每個試驗設置3組平行試驗。培養結束后，3組平行試驗的降解產物分別離心(10 000 r/min，15 min)，上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾，以去離子水為參比，檢測濾液在450 nm處的吸光度A450，求得3組平行試驗的A450平均值作為指標。A450最大者對應的加煤量確定為最佳加煤量。

2)接種量的確定

取最佳加煤量，煤樣粒度0.150～0.075 mm，液體培養基20 mL接種SV母菌液，接種量分別取1.0、1.4、2.0、2.4、3.0、3.4和4.0 mL，培養箱溫度28 ℃，振蕩頻率160 r/min，培養14 d，每個試驗設置3組平行試驗。培養結束后，3組平行試驗的降解產物分別離心(10 000 r/min，15 min)，上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾，檢測濾液在450 nm處的吸光度，求得3組平行試驗的A450平均值作為指標。A450最大者對應的接種量確定為最佳接種量。

3)培養時間的確定

取最佳加煤量，液體培養基20 mL接種SV母菌液，取最佳接種量，煤樣粒度0.150～0.075 mm，培養箱溫度28 ℃，振蕩頻率160 r/min，培養時間分別確6、8、10、12、14和16 d，每個試驗設置3組平行試驗。培養結束后，3組平行試驗的降解產物分別離心(10 000 r/min，15 min)，上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾，檢測濾液在450 nm處的吸光度，求得3組平行試驗的A450平均值作為指標。A450最大者對應的培養時間確定為最佳培養時間。

4)振蕩頻率的確定

分別取最佳的加煤量、接種量和培養時間，液體培養基20 mL接種SV母菌液，煤樣粒度0.150～0.075 mm，培養箱溫度28 ℃，培養箱振蕩頻率分別取60、110、160、210和260 r/min，每個試驗設置3組平行試驗。培養結束后，3組平行試驗分別離心(10 000 r/min，15 min)，上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾，檢測降解液在450 nm處的吸光度，求得3組平行試驗的A450平均值作為指標，A450最大者對應的振蕩頻率確定為最佳振蕩頻率。

1.5 3種褐煤的降解試驗

利用菌株篩選試驗確定的降解菌，根據單因素確定的菌株降解GSLH的最佳工藝條件對GZTH、GHYH和GYBH進行降解試驗，每個試驗設置3組平行試驗。培養結束后，3組平行試驗分別離心(10 000 r/min，15 min)，上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾，以去離子水為參比，檢測降解液在450 nm處的吸光度，求得3組平行試驗的A450平均值作為指標，評價降解效果。

2 結果及討論

2.1 菌株篩選結果

圖1為菌-煤匹配試驗結果，其中C表示培養基對光氧化褐煤在相同條件下的溶煤液吸光度A450，SF、SV、AM、SM和KP表示5種放線菌對GSLH、GZTH、GHYH和GYBH的降解液吸光度A450。

圖1 5種放線菌降解褐煤結果

由圖1可見，4種光氧化褐煤在培養基中的溶解均較少，5種放線菌對GSLH的降解能力強弱順序為SV>AM>SF>SM>KP，對GZTH的降解能力強弱順序為SV>AM>SF>SM>KP，對GHYH的降解能力強弱順序為SV>KP>AM>SF>SM，對GYBH的降解能力強弱順序為SV>AM>SM>SF>KP。由此可見，雖然降解能力的變化程度不一，順序略有差別，但5種放線菌對4種光氧化褐煤的降解能力最強者均為綠孢鏈霉菌(SV)。因此確定綠孢鏈霉菌(SV)為光氧化低階煤的優勢放線菌菌株(圖2)。將1.2節中活化復壯的綠孢鏈霉菌母菌液在530 nm處的吸光度[16-17]，代入已確定的菌濃度-吸光度關系方程，計算得到菌濃度為3.7105cfu/mL。

圖2 綠孢鏈霉菌形貌

2.2 單因素試驗結果

1)加煤量

圖3為加煤量對綠孢鏈霉菌降解光氧化內蒙勝利褐煤降解液吸光度的影響，可知，隨著加煤量增加，A450值先增后減，加煤量為0.2 g(以20 mL培養基計，下同)時，A450達最大值，為2.437，加煤量大于0.3 g后，A450值急劇下降。可能是因為加煤量較少時，菌株分泌的降解煤活性物質與煤中相應的活性點充分作用后還有剩余，雖然降解率達極大值，但降解產物濃度相對較低；當加煤量為0.2 g時，菌株生長過程中分泌的降解煤活性物質與煤中的活性點相互作用程度較充分，雖可能未達到加煤量為0.1 g時的降解率，但由于二者相互作用充分，使相同體積情況下的降解產物濃度較大，故而A450值較大；繼續增大加煤量，由于煤漿濃度過大會抑制菌株的生長，導致菌株生長不旺盛，分泌降解煤活性物質減少，引起A450值減小。因此，20 mL培養基的最佳加煤量為0.2 g。

圖3 加煤量對降解液吸光度的影響

2)接種量

圖4為接種量對綠孢鏈霉菌降解光氧化內蒙勝利褐煤降解液吸光度的影響，可以看出，隨著接種量增大，降解液的吸光度A450迅速增大，當接種量達2.0 mL 時，降解液的A450值達2.541，繼續增大接種量，A450值增加緩慢，接種量達3.0 mL后，A450值變化甚微，故最佳接種量確定為3.0 mL。

圖4 接種量對降解液吸光度的影響

3)培養時間

圖5為培養時間對綠孢鏈霉菌降解光氧化內蒙勝利褐煤降解液吸光度的影響，可見，隨著培養時間延長，降解液的吸光度A450值逐漸增大，10 d后，繼續延長培養時間對降解液吸光度的影響不大，因此最佳培養時間確定為10 d。

圖5 培養時間對降解液吸光度的影響

4)振蕩頻率

圖6為培養箱振蕩頻率對綠孢鏈霉菌降解光氧化內蒙勝利褐煤降解液吸光度的影響，可見，隨著振蕩頻率增大，A450值先增大后減小，最大值2.624出現在轉速160 r/min。這可能是因為隨著振蕩頻率增大，培養基的氣液界面交替更頻繁，使培養基中溶解的氧相對較多，有利于綠孢菌的生長繁衍，綠孢菌可分泌出較多的活性物質，有利于煤的降解；此外，振蕩頻率越大，降解煤活性物質與煤中的活性作用點接觸更充分。振蕩頻率過大時，雖有利于氧氣的溶解及降解煤活性物質與煤中活性點的充分接觸，但劇烈的振蕩可能導致綠孢菌生長的不適應，從而使得綠孢菌產生降解煤活性物的能力降低，降解效果變差。因此，培養箱振蕩頻率確定為160 r/min。

圖6 振蕩頻率對降解液吸光度的影響

2.3 3種褐煤的降解效果

圖7為在單因素確定的最佳工藝條件下，綠孢鏈霉菌對GZTH、GHYH和GYBH降解試驗結果。可見，綠孢鏈霉菌對3種光氧化褐煤的降解液吸光度分別為2.937、2.062和1.649，比菌煤匹配試驗對應的降解液吸光度(2.779、1.798和1.464)均有提高。經單因素試驗確定的綠孢鏈霉菌降解GSLH的最佳條件是綠孢鏈霉菌降解GZTH、GHYH和 GHYH的較優工藝條件，該工藝條件具有一定的普適性。