作物根際微生物組重組構(gòu)建技術(shù)體系探討

孫雨 常晶晶 田春杰

（中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130102）

作物微生物組包括葉、莖、根不同部位的所有微生物基因資源，是作物的“第二套基因組”［1］，不僅蘊(yùn)含著改變作物生長(zhǎng)發(fā)育的重要遺傳資源，更是作物和環(huán)境作用的紐帶，是物質(zhì)循環(huán)生態(tài)鏈不可分割的一環(huán)，在提升作物產(chǎn)能、維護(hù)生態(tài)平衡中發(fā)揮著不可替代的作用［2］。隨著微生物組研究技術(shù)包括現(xiàn)代測(cè)序技術(shù)及分析平臺(tái)的快速發(fā)展，關(guān)于作物微生物組的研究也逐漸深入，并受到越來(lái)越多的重視。例如，國(guó)際公布的未來(lái)農(nóng)業(yè)發(fā)展中最具潛力的五個(gè)領(lǐng)域中，農(nóng)業(yè)微生物組研究是其中之一［3］；在2017年啟動(dòng)的“中國(guó)科學(xué)院微生物組計(jì)劃”中，農(nóng)作物微生物組也是重要研究?jī)?nèi)容之一［4］。

根際是作物-微生物相互作用最為活躍的區(qū)域，土壤微生物與作物地下部分發(fā)生能量和物質(zhì)交換：作物將光合作用固定的碳以根系分泌物和植物殘?bào)w的形式釋放到根際土壤，為微生物提供養(yǎng)分和基質(zhì)［5］；微生物則通過(guò)直接或間接的方式，如促進(jìn)根系養(yǎng)分吸收［6］、提高作物環(huán)境適應(yīng)性［7］、調(diào)控作物免疫反應(yīng)［8］等，影響作物的營(yíng)養(yǎng)代謝和抗逆性能，并最終決定作物的生長(zhǎng)發(fā)育。目前，科學(xué)家圍繞多種作物的根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能變化特征展開了一系列研究，包括玉米［9］、水稻［10］、小麥［11］、大豆［12］和向日葵［13］等。

近年來(lái)，利用微生物技術(shù)促進(jìn)作物營(yíng)養(yǎng)代謝、提高作物抗逆性能等越來(lái)越被重視，特別是針對(duì)作物抗病能力，在減施/不施農(nóng)藥前提下，微生物技術(shù)因其靈活性、有效性、以及降低食品安全隱患而被接受［14］。但傳統(tǒng)微生物技術(shù)常常局限在單株菌的分離、培養(yǎng)和利用，而可培養(yǎng)微生物數(shù)量有限，不足總量的3%-5%［15］，極大限制了抗逆菌株的應(yīng)用。跨越傳統(tǒng)的思路和技術(shù)局限，當(dāng)前針對(duì)作物微生物組的研究提供了從微生物組層面尋找解決這一問(wèn)題的可能：對(duì)根際微生物組進(jìn)行改良、重組和構(gòu)建。雖然根際微生物組的功能研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，并在此基礎(chǔ)上探索了微生物組的人工模擬和重建［16］，但是，根際微生物組重組構(gòu)建相關(guān)技術(shù)體系的打造仍處在初期探索階段，存在巨大提升空間。

當(dāng)前在技術(shù)上想完全復(fù)制任何一種作物的微生物組都似乎不大可能。在現(xiàn)有條件下，努力突破以往單株或單類菌的局限性，盡可能實(shí)現(xiàn)微生物組綜合體系的運(yùn)用則是比較實(shí)際的策略。以往的生產(chǎn)實(shí)踐中，有些已經(jīng)蘊(yùn)含著作物微生物組改良和重組的思路。但是，由于具體目標(biāo)的側(cè)重點(diǎn)不同，并沒(méi)有突出和強(qiáng)化“微生物組”的改變。那么，當(dāng)前有哪些可能的策略有助于實(shí)現(xiàn)作物根際微生物組改良和重組的目標(biāo)？在前人探索基礎(chǔ)上、并結(jié)合我們自己的經(jīng)驗(yàn)和思考，以提高作物抗病能力為例，我們歸納了3種可能實(shí)現(xiàn)根際微生物組改良、重組和構(gòu)建的技術(shù)構(gòu)想（圖1），希望能夠?yàn)榭蒲泄ぷ髡咛峁┮欢ǖ膯l(fā)和借鑒。能否真正實(shí)現(xiàn)應(yīng)用推廣，還需要在不斷實(shí)踐的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提升和完善相關(guān)細(xì)節(jié)。

1 土壤菌懸液接種法

圖1 作物根際微生物組改良和重組的三種技術(shù)體系的初步構(gòu)想

借鑒傳統(tǒng)微生物分離、培養(yǎng)和回接的模式，用根際微生物組菌群代替單株菌對(duì)目標(biāo)作物進(jìn)行接種。針對(duì)根際微生物組，可以采用土壤菌懸液，能夠在較大程度上保留微生物組的類群，包括類群間的比例關(guān)系。Yan等［17］系統(tǒng)研究了不同稀釋濃度的土壤菌懸液接種后的植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的變化，結(jié)果表明，利用土壤菌懸液接種可以有效獲得原始土壤微生物組絕大多數(shù)組成類群，包括變形菌（Proteobacteria）、放線菌（Actinobacteria）、擬桿菌（Bacteroidetes）、酸桿菌（Acidobacteria）、疣微菌（Verrucomicrobia）、浮霉菌（Planctomycetes）和厚壁菌（Firmicutes），占微生物類群總量的90%以上；此外，特定的稀有類群在高倍稀釋的土壤菌懸液中依然能夠保留。Panke-Buisse等［18］研究發(fā)現(xiàn)，使用特定表型擬南芥（開花時(shí)間不同）的根際土壤懸液接種其他擬南芥植株能夠改變目標(biāo)植株的開花時(shí)間，證實(shí)了土壤菌懸液接種能夠通過(guò)作物根際微生物組進(jìn)而改變宿主性狀。當(dāng)前，已有研究表明，使用健康土壤菌懸液接種特定植株，可以增強(qiáng)植株抗病免疫能力［19］。在傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)管理方法中，“客土法”已蘊(yùn)含了微生物組改良的思路，如李集勤等［20］將紅砂土作為“客土”摻混沙泥田耕層土壤，顯著降低了煙草青枯病的發(fā)病率，其主要原因之一是紅砂土中含有大量放線菌，能夠改善煙草根際微生物群落結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)植株對(duì)青枯病原菌的拮抗能力。由于該方法引入了非原位土壤，對(duì)“客土”的土壤質(zhì)量要求較高，而土壤菌懸液接種法能夠一定程度上降低土壤因素帶來(lái)的影響，有利于突出微生物組重組改良的功效。

土壤菌懸液接種法的關(guān)鍵在于菌懸液的制備過(guò)程，van de Voorde等［21］對(duì)土壤菌懸液的制備方法進(jìn)行了研究，比較了經(jīng)1 mm篩和20 μm篩過(guò)濾的菌懸液接種后植物的生物量，發(fā)現(xiàn)后者對(duì)植物的促生長(zhǎng)效果更顯著。這一結(jié)論表明，菌懸液制備方式能夠顯著影響接種效果。此外，土壤菌懸液接種后通常也會(huì)需要一個(gè)富集、培育的過(guò)程，才可以達(dá)到預(yù)期的微生物數(shù)量。Chang等［19］的研究表明，使用黑土菌懸液接種滅菌后的土壤，需要經(jīng)過(guò)48 d的溫室培育過(guò)程，才可以促進(jìn)微生物組在目標(biāo)土壤中獲得足夠量的積累，使其具備黑土微生物類群結(jié)構(gòu)。無(wú)論是菌懸液的制備還是富集過(guò)程，雖然跨越了單株菌的分離培養(yǎng)，依然會(huì)導(dǎo)致微生物類群的丟失，但相對(duì)來(lái)說(shuō)可以在較大程度上實(shí)現(xiàn)微生物組的模擬構(gòu)建。在這一過(guò)程中，可以融合傳統(tǒng)方法得到的抗病菌株以提高改良效果。由于微生物間的相互作用關(guān)系在調(diào)控根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能方面起到重要作用［22］，影響著微生物組的生態(tài)服務(wù)功能，因此，在微生物組的應(yīng)用中，微生物之間的相互作用關(guān)系也是需要考慮的重要因素。在具體實(shí)踐中，我們可以首先篩選能夠分離培養(yǎng)的抗病微生物，再結(jié)合土壤菌懸液的使用，尤其關(guān)注抗病菌株與土壤菌懸液的配比和組合，以尋求最優(yōu)改良效果。

2 作物間作/套種法

如果說(shuō)土壤菌懸液接種法中人為選擇還發(fā)揮著主導(dǎo)作用，作物間作/套種法則更多發(fā)揮作物本身對(duì)微生物組的選擇作用，通過(guò)作物-作物之間的交流實(shí)現(xiàn)微生物組的重組，進(jìn)而達(dá)到改良效果。叢枝菌根真菌和作物的互作研究已經(jīng)證實(shí)，真菌的菌絲橋不僅可以實(shí)現(xiàn)不同植物間的營(yíng)養(yǎng)傳遞，而且能夠?qū)崿F(xiàn)抗病信號(hào)的傳遞，提升作物整體免疫力［23］。

作物間作/套種法的關(guān)鍵在于通過(guò)調(diào)整不同作物的聯(lián)合種植模式，將抗逆作物微生物組有效輸入到目標(biāo)作物根際，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)根際微生物群落的重組和改良，起到提升作物抗逆性能的效果。目前，已有研究報(bào)道了間作對(duì)作物根際微生物群落結(jié)構(gòu)及作物抗病能力的影響。Jin等［24］發(fā)現(xiàn)與單作黃瓜相比，小麥間作的黃瓜根際微生物組中厭氧繩菌（Anaerolineae）、δ-變形菌（Deltaproteobacteria）、浮霉菌（Planctomycetacia）等豐度較高，而α-變形菌（Alphaproteobacteria）和藍(lán)細(xì)菌（Cyanobateria）等豐度較低。此外，小麥與黃瓜的間作提高了有益菌（如假單胞菌屬Pseudomonasspp.和原囊菌屬Archangiumspp.等）在黃瓜根際的定殖比例，改良了黃瓜根際微生物組的群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提高了黃瓜對(duì)枯萎病的抗病能力［24］。

研究表明，由于生存環(huán)境嚴(yán)苛，野生作物的根際微生物組中往往蘊(yùn)含著豐富的抗病微生物資源，在作物抗病中具有重要的應(yīng)用潛力，可以利用其實(shí)現(xiàn)栽培作物抗病［25］。因此，針對(duì)作物微生物組的改良目的，微生物組輸出源可以是抗病品種及野生作物［26-27］。可以將野生作物和栽培作物（包括已有抗病品種）合理搭配組合，通過(guò)彼此之間的交流，將野生作物富集的微生物組輸入到栽培作物，進(jìn)而提升栽培作物的抗病能力。這里的關(guān)鍵在于如何促進(jìn)微生物組在不同植物間的有效傳遞，而這一關(guān)鍵點(diǎn)正是目前仍在探索的地方，在技術(shù)上暫時(shí)沒(méi)有實(shí)現(xiàn)大的突破。此外，還需要考慮現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中如何避免混種或者套種帶來(lái)的外源作物與目標(biāo)作物競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)、光照、水分等情況［28］；且為了促進(jìn)輸出源微生物組的有效抗病性，是否以及如何實(shí)現(xiàn)對(duì)輸出源微生物組進(jìn)行先期抗逆誘導(dǎo)等；這些細(xì)節(jié)是完善該項(xiàng)技術(shù)體系打造的重要內(nèi)容，需要在理論探索基礎(chǔ)上不斷地實(shí)踐摸索。

3 土壤記憶法

決定微生物組類群結(jié)構(gòu)和功能的兩個(gè)主要因素是土壤和作物，上面的方法探討了作物的選擇作用潛在的應(yīng)用可能。此外，我們還可以考慮借助土壤的某些特性，如“土壤記憶”在改良作物根際微生物組中的作用。

土壤記憶法闡述的是，土壤賦予給植物的微生物組類群常常傾向于沿襲上一代在該土壤中生長(zhǎng)的植物所具有的微生物組，也就是所謂的“記憶”。Wei等［29］研究了健康植物和患病植物根際土壤對(duì)下一代植物的影響發(fā)現(xiàn)，健康植物根際土壤能夠顯著降低下一代植物的發(fā)病率，為“土壤記憶”提供了最直接的證據(jù)。此外，Raaijmakers和Mazzola［30］在2016年提出了 “土壤免疫”的概念，指出土壤對(duì)植物病原菌也具有識(shí)別和記憶的功能，一些“抑病土壤”能夠在病原菌再次侵染植物時(shí)表現(xiàn)出對(duì)病原菌的抑制作用，幫助植物抵抗病原菌。而“土壤免疫”的形成與上一代植物被病原菌感染后特異性招募的拮抗微生物菌群以及進(jìn)而構(gòu)建的抗病根際微生物組密切相關(guān)，且微生物間互作關(guān)系也在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用［8，31］。

由于病原菌同樣可以通過(guò)“土壤記憶”傳遞［32］，因此在實(shí)際應(yīng)用中，為了避免發(fā)病，上一代種植的植物最好是抗病品種、或者是爆發(fā)該病害概率較小的其它作物類型，既能一定程度避免土壤中病原菌的傳遞，又能夠?qū)⒖共∑贩N根際富集的微生物組進(jìn)行有效的利用［33-34］。對(duì)黑土農(nóng)田微生物的研究，證實(shí)了 “一方水土養(yǎng)一方微生物”的生態(tài)學(xué)特征，也意味著土壤是決定作物微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的重要因素［35］。若將土壤記憶法應(yīng)用到作物根際微生物組的改良、重組和構(gòu)建中，關(guān)鍵在于尋找合適的輪換作物，以及需要以健康土壤作為培育最初優(yōu)良微生物組的基礎(chǔ)，最終的效果是土壤和作物聯(lián)合作用的綜合體現(xiàn)。

4 展望

除了以上提到的土壤和作物兩個(gè)主要因素之外，農(nóng)業(yè)水資源［36］、大氣資源［37］等也都可能影響著作物微生物組的類群和功能。此外，農(nóng)田管理措施如秸稈還田［38］、減肥增效［39］、調(diào)整種植結(jié)構(gòu)［40］等，也會(huì)在不同程度上改變作物根際微生物組，只是改變方向及可控性還需要詳細(xì)探索。

綜上，本文在前人實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，特別是以“客土法”、“作物間作法”和“作物輪作法”等生產(chǎn)實(shí)踐操作為依據(jù)，初步歸納和探討了3種根際微生物組改良和重組的技術(shù)構(gòu)想，將傳統(tǒng)技術(shù)中涉及微生物組的內(nèi)容更為具體和清晰化，目的在于引導(dǎo)科研工作者積極思考，并針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足開展相關(guān)工作，共同推進(jìn)根際微生物組改良重組技術(shù)體系的打造和完善。未來(lái)進(jìn)一步探索根際微生物組改良和重組的技術(shù)體系，可以考慮在宏基因組基礎(chǔ)上的功能解析、高通量測(cè)序基礎(chǔ)上的核心類群鑒定、并結(jié)合傳統(tǒng)分離培養(yǎng)中高效菌株的培育和改良等綜合手段，把作物學(xué)、土壤學(xué)以及生態(tài)學(xué)等的相關(guān)知識(shí)有效融合，打造高效根際微生物組改良技術(shù)體系，提升作物生產(chǎn)力。