土壤微生物與煙草青枯病發生關系的研究進展

李俊領 馬曉寒 張豫丹 賈瑋 許自成

（河南農業大學煙草學院，鄭州 450002）

青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）是一種重要的土傳病原菌，具有廣泛的寄主范圍，可侵染50多科450余種植物［1］。其引起的煙草青枯病是限制我國煙草生產的主要病害之一。青枯雷爾氏菌通過根部傷口、根尖或次生根進入煙草根部，最終定殖于木質部，繼而產生大量的胞外多糖堵塞維管束組織，造成葉片萎蔫、發黃壞死，最終導致煙株死亡，直接影響著我國煙葉的品質和產量，也造成了巨大的經濟損失［2］。青枯菌致病因子包括IV型鞭毛系統［3-4］、胞外多糖［5］、Ⅲ型分泌系統［2］等。該病菌主要依靠IV型鞭毛系統介導的運動與趨向作用尋找、侵染寄主，并通過Ⅲ型分泌系統、II型分泌系統等將多種毒性因子輸送到胞外致使植物患病［6-7］。PVH1452煙草品種能通過分泌較低含量的草酸來影響青枯雷爾氏菌生物膜的形成及其在煙株根部的定殖［8］。粵煙97品種能通過提高苯丙氨酸解氨酶（PAL）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）等防御酶活性來抵御青枯菌侵染［9］。近年來，我國煙區青枯病發病率呈逐年升高趨勢。據不完全統計，2009年我國煙草青枯病發病面積將近2.6萬hm2，造成的經濟損失高達8 000萬元，而2015年青枯病發病面積達到130萬畝左右，造成經濟損失大約5.5億元［10］。

以往的研究主要集中在運用種植制度［11-12］、化學藥劑［13］、有機肥料［14-16］等手段防治煙草青枯病，而關于煙草青枯病與土壤微生物群落特征之間的關系研究則較為分散且不系統。有研究指出，土壤微生物群落對煙草青枯病發病影響極為關鍵［17］。因此，本文總結了煙草青枯病發病情況與土壤微生物區系特征的變化關系，為推進煙草青枯病的生態防治提供理論和實踐依據。

1 土壤理化性質與煙草青枯病

眾所周知，土壤理化性質與土壤微生物區系的健康息息相關。土壤理化條件的變化在一定程度上影響了土壤微生物的結構組成。例如土壤微生物總量以及細菌、放線菌和真菌數量與土壤有機質含量呈正相關［18］；土壤細菌與土壤有機質、全氮、全磷及堿解氮含量顯著相關［19］。研究表明，土壤酸化會降低硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠菌門（Chlorobi）及接合菌門（Zygomycota）等碳氮代謝菌群豐度，易發生青枯病［20］；而土壤全氮、速效磷含量的提高則會促使土壤微生物區系從細菌型向真菌型轉化，有利于降低青枯病發生率［21］。陳娜［22］指出，煙田速效鉀含量與節桿菌（Arthrobacter）等有益菌豐度呈正相關關系。李小龍等［23］發現，煙田交換性鈣離子含量的增加能提高假單胞菌（Pseudomonas）和溶桿菌（Lysobacter）豐度。已有研究證明，假單胞菌和溶桿菌是重要的青枯病生防菌［24-25］。

土壤理化條件也影響土壤中青枯菌的數量。青枯菌在土壤生存需要適宜的溫度、濕度和pH等條件，土壤溫度低、濕度高、pH適中適合青枯菌存活，而干燥或淹水及過酸或過堿的土壤均不利于其生存。Shekhawat等［26］發現，當土壤溫度為5℃或35℃、干土且通氣差的條件下，青枯菌數量顯著降低。喻延［27］也發現，過高或過低土壤pH均能降低青枯菌的數量，抑制病害的發生。土壤質地也是影響青枯菌生存的一個重要條件，沙壤土質地疏松、保水保肥能力及抑病性較強，因而沙壤土中青枯菌數量明顯低于沙質土和粘質土［28］。此外，李集勤等［29］發現，隨著土壤改良劑的施用，土壤交換性鈣離子含量增加，青枯菌數量減少，病情指數降低。另有研究表明，土壤速效磷含量的增加，能有效抑制青枯菌的生長繁殖，降低青枯病發病率［30］（圖1）。

圖1 土壤理化性質調控青枯病的發生

2 土壤微生物群落結構與煙草青枯病

近年來，隨著16S rRNA和18S rRNA基因測序等分子生物技術的快速發展，越來越多的研究開始關注土傳病害與土壤微生物之間的聯系。研究發現，微生物群落結構（Composition）在發病與健康土壤間的差異可能是影響煙草青枯病發生的關鍵因子之一［31-35］（圖2）。群落結構反映的是物種組成及各物種的豐度［36］，因而圍繞主要物種及其群落組成變化與煙草青枯病的發病情況展開論述。

2.1 主要物種豐度與煙草青枯病

在煙草根際土壤中，主要微生物種類有細菌（Bacteria）、真菌（Fungus）和放線菌（Actinomyces）。青枯菌作為一種細菌性病原菌，在侵染煙株的過程中，會使煙株根際的主要微生物豐度發生變化。陳乾錦等［32］發現，發病土壤中細菌和真菌數量高于健康土壤，而放線菌數量卻低于健康土壤，進一步對發病煙株生理期進行研究發現，細菌和真菌數量從移栽期到發病期（旺長期）呈增多趨勢，且細菌相較于真菌更為顯著。匡傳富等［37］的研究有相似結果，1、2、3號土（青枯病程度由重到輕）中細菌、真菌數量依次由多到少，在生理期中的煙田細菌數量變化也較真菌顯著。李黎紳等［38］的研究發現，發病嚴重的沙田土壤中細菌和真菌數量高于發病較輕或不發病的紫色土壤，而前者的放線菌數量卻明顯低于后者。李小龍等［23］也指出發病煙田中細菌和真菌數量高于健康煙田，而放線菌數量則與之相反。這可能是由于青枯雷爾氏菌影響了根際微生態環境，導致細菌數量增加，進而誘導發病機制［39］。再者，土壤中多種放線菌能產生抗菌素類物質，在一定程度上抑制了土傳病害的發生。

2.2 微生物群落組成變化與煙草青枯病

2.2.1 細菌門水平 變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria）是煙株根際土壤細菌群落的3大優勢菌門。健康和發病（青枯病，下同）土壤的細菌群落組成在門水平上相似，但相對豐度有顯著性差異。健康土壤中酸桿菌門、變形菌門、疣微菌門（Verrucomicrobia）的豐度較高，而在發病土壤中厚壁菌門、擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）的豐度較高。常安然等［40］分析了四種健康土壤的細菌群落發現，細菌以變形菌門和酸桿菌門為優勢類群。Liu等［41］研究發現，常年連發病煙田中的變形菌門和酸桿菌門豐度相較于健康煙田顯著降低。施河麗等［42］對健康和發病煙田的土壤微生物在細菌門水平進行對比發現，健康煙田酸桿菌門豐度比發病煙田高31.67%，疣微菌門豐度是發病煙田的2.28倍，而厚壁菌門、擬桿菌門豐度分別比發病煙田低27.56%和16.88%。林書震［33］研究發現，在健康煙田中變形菌門、疣微菌門豐度分別為32.3%和1.2%，而在發病煙田中分別為28.6%和0.9%，在移栽期與發病期酸桿菌門的豐度分別為19.2%和12.6%，浮霉菌門的豐度分別為1.8%和4.2%。在對邵武煙田的細菌群落進行分析時，發現發病煙田中浮霉菌門、擬桿菌門豐度較健康煙田分別高出 0.32%和0.48%，發病期酸桿菌門的豐度則比移栽期低了2.99%［29］。

2.2.2 細菌屬水平 Berendsen等［43］認為，植物健康不單獨由致病菌和有益微生物的豐度決定，而是受到多種微生物的共同影響。有研究發現，勞爾氏菌屬在健康和發病煙田中均為優勢菌屬，盡管在健康土壤的豐度低于發病土壤，但差異并不顯著［42］。在向立剛等［44］的研究中，同樣發現勞爾氏菌屬是健康土壤的優勢菌屬，但發病土壤的優勢菌屬為假單胞菌。劉曉姣［45］指出，作為具有潛在防治土傳病害功能的芽孢桿菌屬（Bacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）和假單胞菌屬，其豐度在健康與發病土壤中并沒有顯著性差異，且假單胞菌屬在發病煙田的豐度高于健康煙田。Wu等［46］研究發現，在混施土壤改良劑和生物有機肥的土壤中，有益菌大量富集并能聯合抵制煙草青枯病。另有研究指出，根際土壤生態系統可以調控有益菌與青枯菌的競爭作用并使其達到最大化來提高作物根際抗性［47］。此外，一些未分類的細菌，其豐度在健康與發病土壤中也存在差異，如unclassified_f__Micrococcaceae在健康土壤中的豐度為3.0%，而在發病土壤中為1.2%；norank_p__Saccharibacteria在健康土壤中的豐度為1.4%，在發病土壤中為 0.9%［33］。這些未分類的細菌可能會與一些菌屬相互作用，進而影響煙草青枯病的發生，但因無法精確到物種水平上的分類，相關研究還相對較少。

2.2.3 真菌門、科水平 煙草根際土壤的真菌類群主要富集了子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和未分類菌群。其中子囊菌門為真菌菌群中的第一優勢菌門，該菌群在發病土壤中的豐度明顯高于健康土壤。有研究指出，子囊菌門中含有大量病原菌，但這些病原菌不是作物的致病菌，它們通常在植物根部聚集造成根表層破壞，為一些致病菌的侵染創造條件［48］。子囊菌門在受害嚴重的煙田中豐度較高，可能為青枯菌的入侵創造了條件。擔子菌門在健康煙田的豐度高于發病煙田，銀耳綱（Tremellomycetes）屬于擔子菌門，Dipak等［49］研究指出，銀耳綱中的一些真菌在抑制植株根際土傳病害中發揮著重要作用，是有效控制病害的生防菌。在未分類菌群中，norank_k__Fungi的豐度相對較高。有研究指出norank_k__Fungi在健康煙田豐度是發病煙田的2.87倍［32］。另有報道，norank_k__Fungi在煙田移栽期平均豐度為15.2%，發病期僅為4.2%［33］，表明norank-k-Fungi可能屬于有益菌。真菌群落結構的變化可能影響著青枯病害程度［50-51］。如重度發病煙田中被孢霉科（Mortierellaceae）、叢赤殼科（Nectriaceae）豐度較輕度發病煙田分別降低了76.1%、92.3%，糞盤菌科（Ascobolaceae）豐度增加了64.9%［52］；連續生物熏蒸處理煙田后，發現煙田毛發菌科、毛殼菌科（Chaetomiaceae）相對豐度增加，而隨生物熏蒸年限的增加，青枯病害程度降低［53］；趙文宗［54］發現5種嫁接處理的番茄有不同的發病程度，青枯病情指數和發病率與真菌數量呈極顯著負相關，在青枯病癥較重煙田中壺菌門（Chytridiomycota）豐度較高，病癥較輕煙田中Basidiomycota豐度較高。

2.2.4 真菌屬水平 有關學者在真菌屬水平上分析煙田發病原因時，發現假霉樣真菌屬（Pseudallescheria）、鐮刀菌屬（Fusarium）等是造成健康和發病煙田差異的主要菌屬［32］，且兩種菌屬均在發病煙田中豐度較高。林書震等［33］也發現在煙田發病期，Pseudallescheria豐度明顯增加。Pseudallescheria屬于子囊菌門中的小囊菌目（Microascales）；Fusarium是對植物危害最大的絲狀真菌，其分泌的毒素能引起100多種動植物病害［55］，可能會促使煙草青枯病的發生。王婷婷等［56］從發病煙田健康煙株根圍分離得到幾種菌根真菌（Arbuscular MycorrhizaFungi，AMF）發現，幾種AM真菌對青枯病有較好的防治效果。AM真菌對作物根際微生物群落結構的影響被認為是其抑制土傳病害的一個重要機制［57-59］。土壤中某些真菌代謝物也能影響細菌的群落變化，例如AM真菌菌絲分泌物能顯著提高番茄根際細菌數量，抑制青枯菌在根際土壤的定殖，降低青枯菌豐度［60］；球黑孢菌（Nigrospora sphaerica）的代謝產物具有穩定的抑菌活性，能明顯降低土壤青枯菌豐度［61］；刺盤孢菌（Colletotrichum）分泌物芹菜素-8-C-葡萄糖苷（Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside）也能抑制青枯病生防菌Bacillus和Pseudomonas活性，降低它們在土壤中的豐度［62］。AM真菌還能促使植株根系分泌可溶性酚和結合態酚，加強對青枯菌的毒害作用［63］。譚樹朋等［64］把AMF摩西球囊霉（Glomus mosseae，Gm）和地表球囊霉（G. versiforme，Gv）分別與促生長菌芽孢桿菌M3-4菌株互作，發現M3-4菌株能分泌一些化學物質促進AMF菌絲生長，而AMF菌絲的生長為M3-4菌株提供了良好的生態位，增加了M3-4菌株在根際土壤中的豐度，它們之間的相互促進作用能明顯降低青枯病菌數量和病害發生率。

圖2 健康（左）與發病（右）煙田中的優勢菌門

3 微生物生態網絡

土壤中的微生物極少單獨存在，不同種群總是聚集在一起，微生物之間、微生物與其他生物之間及微生物與環境之間存在著各種相互作用。通過平板共培養已確定微生物之間有寄生、共生、拮抗等生存方式。因共培養不能精確的探究原位狀況下土壤微生物間的相互作用，近些年研究者們運用計算機模擬生態網絡構建的方法來探究微生物間的相互作用關系。微生物生態網絡的構建原理是：如果有兩種微生物或OTUs，其豐度呈相同或相反的變化規律，只要相關系數高于顯著性閾值，那么就可以認為這兩種微生物之間存在著正或負相互作用關系；如果計算所有微生物兩兩之間的相關性，就構成了一個完整的相互作用網絡［65］，如equationbased network［66］、Bayesian network［67］、relevance network［68］、CoNet network［69-70］以 及random matrix theory（RMT）-based network［71］等。微生物生態網絡的構建不僅有利于了解原位狀況下土壤微生物間的相互關系，也為維持土壤健康提供了技術支撐。

3.1 土壤微生物生態網絡與煙草青枯病

物種間大量的相互作用對病原菌入侵有很強的抵抗力［72］。Yang等［73］基于隨機矩陣模型對不同發病率煙田進行生態網絡構建，結果發現輕度發病煙田比嚴重發病煙田有更多的節點數（Node）、連接數（Link）和更高的模塊性（Module）。較多節點數和連接數表明生態網絡更復雜，物種間有較多的相互作用，更高模塊性表明某些菌屬占據相同的生態位，可以穩定互惠或共生［71，74］。Wei等［75］的研究也發現，與感染青枯病土壤相比，健康土壤的生態網絡具有更高的節點數和邊數、更長的平均路徑長度和更高的模塊性。類似地，在對番茄青枯病進行研究時發現具有低巢狀、高連通性和明顯生態位的群落社區，能有效降低病原菌的入侵成功率［48］。土壤微生物間的相互作用影響著煙草青枯病的發生，且土壤中微生物相互關系越復雜、擁有更多明顯生態位，其病害發生率越低（圖3）。

3.2 關鍵微生物與煙草青枯病

普遍認為，作物都有能夠抑制病原體的關鍵微生物群［76］，其中一些關鍵微生物（Key）在維持整個生態系統結構和功能穩定方面也起著至關重要的作用［77-78］。為揭示與煙草青枯病相關的關鍵微生物，有學者在生態網絡中引入最大連接度節點［79］、最大相互性與中心壓力［80］、最高特征向量中心度的概念共同表征關鍵微生物［81］。結果發現不同取樣點的健康煙田關鍵微生物類群較一致，主要包括芽孢桿菌屬等，但不同取樣點的中度發病和嚴重發病煙田關鍵微生物類群卻不一致，這可能是由于發病煙田的致病因子復雜多變［82］，其關鍵微生物也在不斷變化。另有學者用NESH識別微生物網絡中關鍵微生物類群發現，健康土壤中的芽孢桿菌、假單胞菌和放線

菌是抑制青枯病菌的關鍵微生物［83］，它們是非核糖體抗菌肽和聚酮類化合物等關鍵抑菌物質的最佳生產者［84-85］，能有效防治煙草、苜蓿［86］、黃瓜［87］等多種作物的病害。此外，稀有類群也能發揮關鍵性作用，如Li等［88］研究發現，患病植物微生物群中缺乏某些稀有類群，致使作物受到了病原體感染。稀有類群可能是一個未開發的有益微生物庫［89］，能有選擇性地在土壤中富集［90］。有益微生物富集的煙田，物種豐富度指數和多樣性指數較高，青枯病害發生率較低［47］，這可能是由于有益微生物串聯了相關菌屬形成了復雜的生態網絡，進而抑制病害發生。

4 微生物防治煙草青枯病的作用機制

利用土壤中的有益微生物及其代謝產物抵御作物病害是一種安全、可持續的防治方法，目前主要應用以下4種作用機制方式防治青枯病（圖4）。

4.1 競爭作用

有益微生物與病原菌的競爭作用主要包括營養競爭和侵染位點競爭。除2.2.4提到的菌根真菌外，鄭繼法等［91］從番茄、辣椒根際土壤中分離得到的產細菌素菌株，能同青枯菌爭奪煙株根際營養和生態位點，對青枯病的防治有明顯效果。易有金等［92］對煙株接種青枯菌和短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis），發現Brevibacillus brevis能優先定殖在煙株根部位點，阻止青枯菌的侵染。Yuan等［93］把Bacillus amyloliquefaciensSQR-7、SQR-101和B.methylotrophicusSQR-29接種在煙苗中，發現這些內生菌能與青枯菌進行鐵離子競爭，從而降低了病害發生率。

圖3 土壤微生物多樣性、微生物間的相互作用與青枯病發病率關系

4.2 拮抗作用

拮抗作用是指微生物產生的某些代謝物質對病原菌抑制或殺死的效應。劉雅婷等［94］從土壤中分離得到一些拮抗活性較強的菌株，這些菌株可以通過產生細菌素來抑制青枯菌的活性。Anuratha等［95］發現熒光假單胞桿菌（Pseudomonas fluorescens）產生的抗生素和噬鐵素對青枯菌有較好的抑制作用。此外，陳亮等［96］發現解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）也能通過分泌脂肪酸等活性物質來抑制煙草青枯病菌的生長。

4.3 誘導抗性

誘導抗性是指微生物能誘導植物體內產生有益于抗病性增強的生理生化反應。程小龍［97］通過對煙株外施適宜濃度的水楊酸（Salicylic acid，SA）來促進土壤中枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的生長，進而誘導增強了煙株對青枯病的抗性。陳達［98］利用無致病力的phcA、hrp青枯菌突變株誘導了煙株中茉莉酸（Jasmonic acid，JA）和SA信號途徑的抗性基因表達，提高了煙株對青枯病的系統抗性。董春等［99］利用無致病力的青枯菌株Tm3對青枯菌株Tm46進行抑菌試驗，發現Tm3菌株能誘導植株產生過敏性反應。

4.4 促進植物生長

土壤中的有益微生物可以促進植株的生長發育，從而增強植株的抗病性。陳巧玲等［100］向生物有機肥中添加短芽孢桿菌（Brevibacillus）并施用于煙田發現，煙株生長迅速且青枯病害發生率明顯降低。芽孢桿菌屬中的一些微生物能產生IAA等生長調節劑促進植株生長，進而抵御青枯菌的侵染［93］。肖相政等［101］把枯草芽孢桿菌X-4接種到番茄植株上，發現與對照相比，接種植株生長迅速，生物量顯著增加，且青枯病害程度較輕。

5 展望

煙草青枯病是一種細菌性土傳病害，也是危害我國煙草生產的主要病害之一。微生物是土壤生態系統最重要的組成部分，在作物土傳病害的防治方面也起著十分重要的作用。近年來，隨著分子生物技術的快速發展，越來越多的研究開始關注土壤微生物群落與土傳病害的相互關系，利用微生物多樣性控制作物病害已成為實現“綠色植物保護”極有希望的途徑之一。目前在土壤微生物與青枯病發生關系方面的研究表明：土壤pH、速效鉀、交換型鈣離子、全氮等能分別影響碳氮代謝菌群、有益菌、生防菌及真菌豐度來調控煙草青枯病。土壤質地、溫度、濕度、速效磷等能直接影響青枯病菌數量；Bacteria、Fungus對病害發生起正面作用，Actinomyces起負面作用；Node、Link、Module、Key等一些生態網絡拓撲特性參數和關鍵微生物對病害的發生表現為一定程度的負效應。由于青枯菌致病系統復雜、致病因子多樣，需多種手段并用來防治。微生態平衡是控制煙草青枯病重要的基礎與保障，采取農業措施與生物防治相結合的措施，改善土壤環境，構建土壤營養、酸堿度、根際微生物與煙株生長的平衡體系，將有益于在煙草青枯病的防治中實現新的突破。

圖4 有益微生物防治煙草青枯病的作用機制

大多研究只分析了發病與健康土壤之間的差異種群，在有益微生物的挖掘以及利用方面未進行細致而深入的研究。因此，以下問題也值得進一步思考：（1）青枯病菌侵染煙株是一個動態變化過程，但大多數研究只比較了最終健康和發病土壤樣品的差異特性，并沒有關注發病過程中的微生物群落變化。（2）對于發病土壤中一些門和屬分類下的微生物豐度變化，因未通曉其變化原因，所以不能闡明微生物的分類和功能差異是如何導致煙株發病的。（3）對微生物之間的相互作用研究得還不夠深入，尚未明確哪些微生物聯合侵染煙株或抵抗青枯病，更不清楚它們如何互相作用。（4）對關鍵微生物的研究還處于初級階段，不能明確關鍵微生物如何發揮作用及如何串聯其他菌屬抵御青枯病。此外，礦質元素的缺失也是導致煙草青枯病發生的重要因子，但大多數集中在與大量元素相關的研究當中，對微量元素如鉬、硒等相關報道則較少。

綜上，今后的研究需聚焦發病過程中微生物區系的動態變化，挖掘有益微生物，重點探究有益微生物抵抗青枯菌的作用機制，致力解決生防菌在土壤中的定殖難題。另外，微量抗逆元素（如硒）對煙草青枯病根際土壤微生物區系的調控作用也值得進一步關注。