馬鈴薯根際產(chǎn)IAA芽孢桿菌的分離鑒定及促生效果研究

李培根 要雅倩 宋吉祥 王天琪 周波 王冰 林榕姍

（1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安 271018；2. 山東省鹽堿地植物-微生物聯(lián)合修復(fù)工程技術(shù)研究中心，泰安 271018）

馬鈴薯（Solanum tuberosum）是茄科茄屬的一年生草本植物，是繼水稻、小麥、玉米之后第四大糧食作物［1］，自2014年以來(lái)，我國(guó)馬鈴薯總產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)的1/4，種植面積占世界總種植面積的29%［2］。

植物根際促生細(xì)菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是指有一類存在于植物根際周圍的細(xì)菌，該細(xì)菌能促進(jìn)植物對(duì)養(yǎng)分的吸收和利用，同時(shí)通過(guò)激素促進(jìn)植物生長(zhǎng)、成熟，從而達(dá)到提高農(nóng)作物產(chǎn)量的目的［3］。

吲哚-3-乙酸（IAA）是一種能夠作用于植物生長(zhǎng)、發(fā)育全過(guò)程的一種生長(zhǎng)激素，IAA會(huì)影響植物細(xì)胞的分裂、伸長(zhǎng)、分化和種子萌發(fā)、根系的發(fā)育以及營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程［4］。在雙子葉植物中，IAA能夠促進(jìn)側(cè)根的生成；在單子葉植物中，能夠促進(jìn)不定根的形成。IAA對(duì)植株的響應(yīng)受到光照、重力、植株花期和結(jié)實(shí)期的影響，對(duì)于植物光合作用、色素的形成、各種代謝物的合成以及抗逆性方面具有重要意義［5］。

本研究從黑龍江采集的馬鈴薯根際土壤中獲得多株具有產(chǎn)IAA能力的菌株如HL379、HL343、HL344等，通過(guò)對(duì)HL379進(jìn)行擬南芥促生試驗(yàn)、馬鈴薯盆栽試驗(yàn)等促生效果研究，發(fā)現(xiàn)HL379具有明顯的促生能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 2018年10月于黑龍江齊齊哈爾、雙鴨山、大慶等多地區(qū)的馬鈴薯產(chǎn)地采集的馬鈴薯根際土壤，采集時(shí)除去地塊表層5 cm浮土，取耕作層土壤，4℃保存。

1.1.2 供試材料 馬鈴薯品種為大豐三號(hào)。擬南芥品種為Col-0擬南芥野生型。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g、NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0。

IAA初篩培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g、NaCl 10.0 g，L-色氨酸0.2 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0［6］。

Salkowski比色劑：50 mL 35%高氯酸中加入1 mL 0.5 mol/L FeCl3。TSA（胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基）：胰酪胨15 g，大豆木瓜蛋白酶水解物5 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，去離子水1 000 mL，pH7.3。

MS培養(yǎng)基：大量元素：NH4NO31 650 mg/L、KNO31 900 mg/L、CaCl2·2H2O 440 mg/L、MgSO4·7H2O 370 mg/L、KH2PO4700 mg/L；微量元素：KI 0.83 mg/L、H3BO36.2 mg/L、MnSO4·4H2O 22.3 mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L、Na2MnO4·2H2O 0.25 mg/L、CuSO4·5H2O 0.025 mg/L、CoCl2·6H2O 0.025 mg/L、FeSO4·7H2O 27.8 mg/L、Na2-EDTA·2H2O 37.3 mg/L、有機(jī)成分：肌醇100 mg/L、煙酸0.5 mg/L、鹽酸吡哆醇（維生素B6）0.5 mg/L、鹽酸硫胺素（維生素B1）0.5 mg/L、甘氨酸2 mg/L、瓊脂7 000 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)IAA芽孢桿菌的篩選

1.2.1.1 芽孢桿菌的分離 取1 g土壤樣品，加入至99 mL無(wú)菌水中，37℃，180 r/min，震蕩30 min后充分混勻，制作成10-2濃度的土壤懸濁液，后將土壤懸濁液置于80℃水浴鍋水浴20 min。取1 mL稀釋的土壤懸濁液加入至9 mL無(wú)菌水中，依次稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6濃度。使用稀釋平板法將稀釋的土壤懸濁液取100 μL涂布至LB固體培養(yǎng)基中涂至LB平板變干，分離土壤中的芽孢桿菌，每個(gè)梯度3個(gè)平行，至37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，挑取形態(tài)、顏色、大小不同的菌株進(jìn)行分離，分離獲得的菌種劃線純化后獲得單菌落，置于LB斜面37℃培養(yǎng)，于4℃冰箱保藏。

1.2.1.2 產(chǎn)IAA芽孢桿菌初篩 將斜面保藏的菌體重新活化至LB固體培養(yǎng)基中以恢復(fù)菌體活性，后用接種環(huán)挑取1環(huán)單菌落接種到含L-色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中。30℃培養(yǎng)48 h。取1 mL發(fā)酵液4 000 r/min離心10 min，取100 μL上清液滴加在白色陶瓷板中，加入同體積的Salkowski比色劑，混勻，同時(shí)取100 μL 20 mg/mL的IAA標(biāo)準(zhǔn)溶液與同體積Salkowski比色劑混合作為空白處理。在常溫避光反應(yīng)30 min后觀察顏色變化。若產(chǎn)生紅色反應(yīng)則說(shuō)明有IAA的產(chǎn)生且紅色越深說(shuō)明IAA產(chǎn)量越高。

1.2.1.3 產(chǎn)IAA芽孢桿菌復(fù)篩

（1）IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取IAA標(biāo)準(zhǔn)品與蒸餾水配置成10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L的IAA標(biāo)準(zhǔn)溶液，與Salkowski比色劑1∶1比例混合后，避光常溫靜置30 min，以蒸餾水與Salkowski比色劑混合為空白對(duì)照，在OD530處使用紫外分光光度計(jì)測(cè)得各濃度的吸光度。以IAA濃度為橫坐標(biāo)以吸光度為縱坐標(biāo)繪制IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）IAA含量測(cè)定：將菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48 h。取2 mL發(fā)酵液4 000 r/min離心10 min，取1mL上清液加入等量的Salkowski比色劑于石英比色皿中，在OD530紫外分光光度計(jì)測(cè)該菌株的吸光度。將獲得菌株上清液吸光度代入IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得該菌株的IAA產(chǎn)量。

1.2.2 產(chǎn)IAA芽孢桿菌生理生化與鑒定

1.2.2.1 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》通過(guò)菌種在LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后觀察菌種的形態(tài)（包括形態(tài)、顏色、邊緣、表面、透明度等，通過(guò)對(duì)菌種進(jìn)行革蘭氏染色并用油鏡進(jìn)行觀察確定菌株類型。對(duì)其進(jìn)行檸檬酸鹽利用、V-P試驗(yàn)、酶活測(cè)定、生長(zhǎng)溫度測(cè)定。

1.2.2.2 Biolog系統(tǒng)分析 將在LB固體培養(yǎng)基活化好的菌株接種到TSA培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌棉棒蘸取少量菌體，混入IF-B接種液中，使用濁度儀將濁度調(diào)至90%-98%T，接種液倒至V型加樣槽，使用排槍每孔100 μL依次打入GENE Ⅲ板中，反應(yīng)24-36 h后，通過(guò)微生物檢定系統(tǒng)進(jìn)行比對(duì)，確定菌屬。通過(guò)GENE Ⅲ板對(duì)目的菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

1.2.2.3 16S rDNA鑒定 分離得到的菌株通過(guò)天根生物科技公司提供的細(xì)菌基因組試劑盒進(jìn)行提取16S rDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增引物為細(xì)菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）與1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。反應(yīng)條件為95℃ 5 min；94℃ 60 s；55℃ 60 s；72℃ 90 s；延伸72℃ 10 min循環(huán)30次。PCR擴(kuò)增完成后通過(guò)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)是否PCR成功，將獲得的特異性DNA送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast比對(duì)，使用mega7.0建立發(fā)育樹并獲得目的菌株親緣遠(yuǎn)近關(guān)系。

1.2.3 促生效果實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 擬南芥促生實(shí)驗(yàn) 擬南芥種子用70%酒精消毒40-60 s后，再使用2%濃度的次氯酸鈉浸泡消毒6 min，用無(wú)菌水洗滌6-8次，接種到1/2MS培養(yǎng)基中。4℃暗置春化2 d，取出置于24℃光照培養(yǎng)箱中，晝夜比為2∶1。生長(zhǎng)7 d后，加入裝有106CFU/L HL379菌體的無(wú)菌水，在1/2MS培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線后培養(yǎng)7 d后測(cè)量生物量。

1.2.3.2 馬鈴薯盆栽促生實(shí)驗(yàn) 取當(dāng)季新鮮的大豐三號(hào)脫毒馬鈴薯種薯，0.001 g/L赤霉素與0.2 g/L的磷酸二氫鉀浸泡30 min，將馬鈴薯種薯蓋于濕潤(rùn)的厚紗布保持濕潤(rùn)催芽7 d后移栽至蛭石與土體積比為1∶1的花盆中，待馬鈴薯出苗后灌入目的菌株發(fā)酵液，濃度稀釋至106CFU/mL，每盆灌根200 mL，空白處理為加入同體積的液體培養(yǎng)基。待生長(zhǎng)40 d后測(cè)其生物量，測(cè)量馬鈴薯植株的株高、鮮重、干重、根總長(zhǎng)等促生指標(biāo)。90 d收獲時(shí)測(cè)其產(chǎn)量。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)IAA芽孢桿菌的篩選

從黑龍江齊齊哈爾、雙鴨等地采集的根際土樣中篩選出11株產(chǎn)IAA的芽孢桿菌測(cè)得HL379、HL465和HL436的IAA產(chǎn)量較高，其產(chǎn)IAA量分別達(dá)到47.8 mg/L、46.5 mg/L和44.8 mg/L。其他產(chǎn)IAA菌種的IAA產(chǎn)量也在10-40 mg/L的產(chǎn)量區(qū)間內(nèi)，也有一定的促生潛力。取產(chǎn)IAA量最高的菌株HL379進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖1，圖2）。

圖1 部分菌株產(chǎn)IAA初篩結(jié)果

圖2 部分菌株IAA產(chǎn)量

2.2 產(chǎn)IAA芽孢桿菌的生理生化及分子鑒定

目的菌株HL379在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，菌體呈白色、菌落圓形，邊緣凸起，表面呈光滑干燥狀態(tài)。經(jīng)革蘭氏染色后油鏡進(jìn)行觀察，HL379為革蘭氏陽(yáng)性菌。對(duì)HL379進(jìn)行生理生化檢測(cè)，菌株HL379能夠分解利用淀粉、檸檬酸鹽，在接觸酶反應(yīng)和苯丙氨酸脫氨酶反應(yīng)中呈陽(yáng)性，V-P試驗(yàn)中呈陰性，符合芽孢桿菌屬生理生化特性（圖3，表1）。

圖3 HL379菌落形態(tài)（左）與革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果（右）

表1 HL379菌株生理生化檢測(cè)

以HL379菌株的DNA為模板獲得1.4 kb的特異性DNA片段。經(jīng)16S rDNA測(cè)序獲得HL379菌株16S rDNA序列，通過(guò)在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast序列比對(duì)。比對(duì)結(jié)果經(jīng)mega7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

在NCBI通過(guò)Blast序列比對(duì)得到HL379與阿耶波多氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）（MK517594.1）的一致性達(dá)到100%，通過(guò)建立系統(tǒng)發(fā)育樹顯示HL379與阿耶波多氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）（EF114313.2）自展值達(dá)到99%，確認(rèn)HL379菌株為阿耶波多氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）（圖4）。

利用Biolog鑒定系統(tǒng)對(duì)菌株HL379進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果表明HL379菌株能夠利用葡萄糖、果糖等單糖類物質(zhì)，也能利用山梨醇、甘露醇等醇類物質(zhì)（表2）。

2.3 HL379促生效果驗(yàn)證

圖4 HL379 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 HL379 Biolog生理生化鑒定

2.3.1 擬南芥促生實(shí)驗(yàn) 待擬南芥生長(zhǎng)7 d后，測(cè)其鮮重、干重、根長(zhǎng)。研究表明HL379處理后的擬南芥相對(duì)于空白組干重變化不明顯。在根長(zhǎng)方面增加了11%但沒有顯著性變化（表3，圖5）。

2.3.2 馬鈴薯盆栽實(shí)驗(yàn) 對(duì)40 d的馬鈴薯進(jìn)行生物量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，HL379處理過(guò)的馬鈴薯植株在株高、鮮重、干重、根總長(zhǎng)等方面分別相比于空白組增加了13%、32%、107%、20.8%。鮮重、干重、根總長(zhǎng)等方面具有顯著性差異（P＜0.05）（表4）。

表3 擬南芥促生實(shí)驗(yàn)

圖5 擬南芥促生實(shí)驗(yàn)

表4 馬鈴薯生物量測(cè)定（40 d）

通過(guò)盆栽實(shí)驗(yàn)將施有HL379且生長(zhǎng)90 d成熟馬鈴薯的進(jìn)行產(chǎn)量測(cè)定，處理組相比對(duì)照組在馬鈴薯產(chǎn)量上增加38%。這說(shuō)明HL379對(duì)馬鈴薯有一定增產(chǎn)效果（表5，圖6）。

表5 馬鈴薯產(chǎn)量（90 d）

圖6 馬鈴薯90 d產(chǎn)量

3 討論

PGPR的作用機(jī)制大致分為兩類，一類直接促生作用，另一類為間接促生作用。直接促生作用包括提高植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可得性，增強(qiáng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素如氮源、磷源、鉀源等離子的利用來(lái)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)及增產(chǎn)［7］；另一方面直接促生作用還包括了一類植物激素等信號(hào)因子，如吲哚乙酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素、乙烯等物質(zhì)對(duì)植物體生長(zhǎng)、果實(shí)成熟等方面具有良好的促生作用［8］。另一類為間接促生作用，間接促生包括抑制病原菌的生長(zhǎng)、激活自身的免疫系統(tǒng)機(jī)制等方面，通過(guò)抵御外界病菌的侵害［9］以及激發(fā)植物本身的免疫系統(tǒng)來(lái)促進(jìn)植株生長(zhǎng)［10］。

吲哚乙酸（IAA）是一類植物內(nèi)源生長(zhǎng)激素，作為信號(hào)因子能夠促進(jìn)植物根系的伸長(zhǎng)和增加，從而增加植物養(yǎng)分的攝取［11］。已報(bào)道文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)多種菌屬具有分泌IAA的能力［12］。自1978年［13］首次發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能夠產(chǎn)生IAA后，40年來(lái)發(fā)現(xiàn)了大量的產(chǎn)IAA菌株，其中以假單胞菌（Pseudomonassp.）［14］、芽孢桿菌屬（Bacillussp.）［15］、克雷伯氏菌屬（Klebsiellasp.）為主［16］。目前，我國(guó)農(nóng)業(yè)化學(xué)肥料使用量巨大［17］，但化學(xué)肥料使用過(guò)度導(dǎo)致的土壤有機(jī)質(zhì)含量降低、酸化、土壤板結(jié)等不利影響也逐年加重［18］，因此近年來(lái)對(duì)于促生菌來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)越來(lái)越受到人們關(guān)注。PGPR在番茄［19］、玉米［20］、水稻［21］等多種作物中檢測(cè)出有良好的促生能力。田洪先［22］等報(bào)道了利用馬鈴薯內(nèi)生菌來(lái)促進(jìn)馬鈴薯植株的生長(zhǎng)及產(chǎn)量的增加，Kesaulya等［23］報(bào)道馬鈴薯根際菌株篩選來(lái)促進(jìn)馬鈴薯的生長(zhǎng)。

國(guó)內(nèi)在馬鈴薯根際細(xì)菌方面文獻(xiàn)報(bào)道以抗病機(jī)制為主［24-26］，而關(guān)于馬鈴薯根際細(xì)菌促生效果的研究報(bào)道較少。本研究從黑龍江齊齊哈爾篩選出一株產(chǎn) IAA 能 力 較強(qiáng)的菌 株 HL379，其 IAA 產(chǎn) 量 達(dá)到 47.8 mg/L。通過(guò)馬鈴薯盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證其促生、增產(chǎn)能力。通過(guò) 16S rDNA序列分析結(jié)果結(jié)合 Biolog微生物鑒定系統(tǒng)將其鑒定為阿耶波多氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）。

阿耶波多氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）是于2009年首次在印度通過(guò)高空采集發(fā)現(xiàn)的新菌種［27］，目前在深海［28］、高原［29］、根際土壤［30］發(fā)現(xiàn)阿耶波多氏芽孢桿菌。同時(shí)阿耶波多氏芽孢桿菌在大分子降解［31］、植物促生［32］方面的作用都有所報(bào)道。

近年來(lái)，阿耶波多氏芽孢桿菌應(yīng)用在促生抗逆方面的報(bào)道較多，楊瑩等［33］通過(guò)一株具有解磷抗旱功能的阿耶波多氏芽孢桿菌。劉軍生等［34］篩選出一株具有抗鎘能力的阿耶波多氏芽孢桿菌并對(duì)小麥進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)其具有明顯的降低土壤中鎘元素的能力。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)馬鈴薯根際土壤進(jìn)行篩選獲得一株IAA產(chǎn)量較高的阿耶波多氏芽孢桿菌，為新型微生物肥料的研發(fā)提供了良好的菌種資源。但該菌在實(shí)際生產(chǎn)中最佳生產(chǎn)用量、最佳使用方法以及對(duì)土壤中其他微生物群落影響等方面還需進(jìn)一步探究驗(yàn)證。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)馬鈴薯根際土壤進(jìn)行篩選，獲得11株產(chǎn)IAA菌株，其中IAA產(chǎn)量最高的菌株為HL379，將HL379鑒定為阿耶波多氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）。HL379的馬鈴薯促生盆栽實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)馬鈴薯有較好的促生結(jié)果。