尖鐮孢黃瓜專化型枯萎病菌拮抗菌的篩選、鑒定及培養條件優化

張美君 吳慶 尹翠 王妮 馬曉慶 馬曉霞 曹云娥

（寧夏大學農學院，銀川 750021）

黃瓜是我國重要的栽培作物，其栽培面積和產量位居世界首位［1］。隨著需求量的增加及栽培面積的不斷擴大，連作現象嚴重，導致土傳病害日益加重。由尖鐮孢黃瓜專化型（Foc）引起的黃瓜枯萎病是影響黃瓜產量的主要土傳病害之一，一般可減產15%-25%，嚴重時產量減半甚至絕產，已嚴重制約了設施栽培黃瓜的可持續生產［2］。防治黃瓜枯萎病是黃瓜作物種植中亟待解決的重要產業問題之一。目前生產上的防治方法以化學防控為主，結合抗病品種，田間輪作、嫁接等措施達到防治目的，但化學藥劑的使用易造成病原菌抗藥性的產生、同時還存在農藥殘留和生態環境破壞等問題［3］。生物防治主要通過有益微生物調節植物根部微生態環境，修復土壤微生物群落結構和功能，從而抑制土傳病原真菌的繁殖，是一種的安全、環保的防治措施［4］。

蚯蚓糞是蚯蚓消化有機廢棄物進行生物降解而產生的生物有機肥料［5］，具有良好的團粒結構和較高透氣性，被廣泛應用于有機肥、土壤改良劑和盆栽基質等方面［6］。Ravindran 等［7］研究證明，蚯蚓糞堆肥中含有豐富的細菌、放線菌和真菌，對部分植物病害有一定的抑制作用。而且越來越多的研究表明許多具有開發前景的抑菌活性物質由蚯蚓堆肥微生物產生，其防治土傳病害的作用也逐步成為現階段應用研究所關注的熱點［8］。

目前應用于黃瓜枯萎病防治的生防菌大部分都是從土壤或植物根際分離所得，從蚯蚓糞中篩選用于黃瓜枯萎病害的防治研究較少。菌株具有拮抗作用的原因之一是能分泌代謝活性物質，同時拮抗作用發揮強弱的關鍵是其產量的多少，而培養基成分、發酵條件是影響其產量的重要因素。鑒于此，以尖鐮孢黃瓜專化型枯萎病菌（Foc）為靶標菌，從蚯蚓糞中分離篩選獲得一株具有較強抑制尖鐮孢黃瓜專化型病菌活性的解淀粉芽孢桿菌WQ-5，通過單因素篩選和響應面分析法優化菌株WQ-5培養條件，通過防效試驗驗證拮抗細菌WQ-5對尖鐮孢黃瓜專化型引起的黃瓜枯萎病的防治效果，以期為枯萎病的生物防治提供新的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

病原菌株：尖鐮孢黃瓜專化型（Fusarium oxyporumf. sp.cucumerinum）編號為37374和尖鐮孢西瓜專化型（Fusarium oxyporumf. sp.niveum）編號為36367的菌種購自中國工業微生物菌種保藏中心；尖鐮孢甜瓜專化型（Fusarium oxyporumf. sp.melonis）由寧夏大學園藝實驗室保存。

菌株篩選來源：蚯蚓糞采集自寧夏萬輝生物環保科技有限公司蚯蚓養殖園，是由活蚯蚓消解新鮮牛糞所得。有機質含量30.6%，氮、磷和鉀含量分別為1.6%、1.3%和1.0%，pH 6.9，水分38.5%。

培養基：LB營養瓊脂和LB肉湯用于拮抗細菌的分離及培養［9］；PDA培養基用于病原真菌的活化及培養［9］；KMB培養基用于拮抗細菌的發酵［10］。

供試作物：黃瓜（品種為“德爾99”）。

1.2 方法

1.2.1 蚯蚓糞中拮抗細菌的分離及篩選 稱取10 g蚯蚓糞樣品放入裝有90 mL無菌水的三角瓶中，震蕩20 min，獲得蚯蚓糞懸浮液。將懸浮液稀釋后，得到10-4、10-5、10-6系列濃度梯度，然后依次吸取0.1 mL涂布在LB營養瓊脂平板上，置于30℃恒溫箱中培養24 h，挑取形態各異的菌落進行數次劃線純化，編號并保存于4℃冰箱中備用。

采用平板對峙法在直徑為9 cm的PDA平板中心打孔后將直徑為5 mm的尖鐮孢黃瓜專化型枯萎病病原菌餅放入孔內，把純化后的菌株用無菌牙簽點接至病原菌2.5 cm處，對照為單獨接種病原菌的平板，重復3次，在28℃恒溫培養箱中培養，于6 d、9 d和12 d時測量病原菌的菌落直徑，并計算抑菌率，抑菌率（%）= 對照菌落直徑-處理菌落直徑/（對照菌落直徑-5）×100［10］。純化、保留抑制效果最佳的菌株。同時測定抑制效果最佳菌株對尖鐮孢西瓜專化型枯萎病菌和尖鐮孢甜瓜專化型枯萎病菌的抑菌效果。

1.2.2 拮抗菌株的鑒定

1.2.2.1 形態學和生理生化鑒定 將篩選出的菌株接種于LB平板上，放入恒溫培養箱內30℃培養24 h，觀察其菌落形態特點以及進行常規革蘭氏染色。菌株的生理生化鑒定參考《常見細菌系統鑒定手冊》［11］。

1.2.2.2 16S rRNA序列分析及系統發育樹的構建

將菌株送至北京奧科鼎盛生物技術有限公司，使用細菌16S rRNA基因通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）擴增細菌16S rRNA基因。PCR反應體系：基因組DNA 1.0 μL，10×Buffer 5.0 μL，extaq 0.25 μL，dNTP 2.0 μL，ddH2O 39.75 μL，通用引物各1 μL。PCR反應條件：98℃ 30 s預變性，30個循環（98℃10 s；55℃ 30 s；72℃ 90 s），72℃ 5 min。反應停止后對PCR產物進行回收及測序。在GenBank中進行測序結果BLAST相似性比對，通過MEGA 7.0的Neighbor-Joining進行序列分析并構建系統發育樹，Bootstrap自檢值設為1 000，確定該菌株的分類地位。

1.2.3 拮抗菌株的最適培養條件優化

1.2.3.1 拮抗菌株的培養條件單因素優化 發酵培養基組分優化：在KMB培養基中原有組分不變的前提下，采用不同的碳源（葡萄糖、蔗糖、淀粉、檸檬酸鈉和果糖），濃度為20 g/L，接種量2%（接種液濃度為1×108CFU/mL），裝液量20%，pH 7.0，于30℃，180 r/min震蕩培養24 h后，測定拮抗菌株發酵液的OD600值；采用不同的氮源（硝酸鉀、酵母粉、氯化銨和尿素）替換KMB培養基的蛋白胨，濃度為20 g/L，培養條件與碳源相同，測定拮抗菌株發酵液的生長量（OD600）；在KMB培養基中原有組分不變的前提下，采用不同的無機鹽（硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鋅、硫酸亞鐵、硫酸錳），濃度為1.5 g/L，培養條件與碳源相同，測定拮抗菌株發酵液的生長量（OD600）。

發酵條件優化：發酵培養基組分不變，分別在不同接種量（1%-5%）、不同裝液量（10%-50%）、不同發酵溫度（27-39℃）、不同發酵初始pH值（5-9）、不同振蕩器轉速（150-270 r/min）的條件下，測定拮抗菌株發酵液的生長量（OD600）。

1.2.3.2 響應面分析法優化試驗設計 基于單因素試驗，用OD600作為響應值并以酵母粉用量、裝液量和pH為因變量設計出3因素5水平的響應面試驗（表1）。

表1 Central Composite Design試驗設計的因素與水平

1.2.4 培養條件優化前后抑菌效果比較 用抑制菌絲生長速率法［12］測定拮抗菌的抑菌率。將菌懸液1 mL（1×108CFU/mL）接種于LB液體培養基中制備種子液，30℃、180 r/min振蕩培養24 h后將種子液接入優化后的發酵培養基中，在優化條件下培養24 h，10 000 r/min離心10 min，0.22 μm的微孔濾膜過濾上清液后，得到無菌發酵濾液。取45 mL冷卻至45℃左右的PDA培養基與5 mL的無菌發酵濾液混勻制成帶藥平板，中間接種病原菌菌餅（d=5 mm），以不加發酵濾液的PDA培養基平板為對照，28℃培養6 d，用十字交叉法測其生長直徑，計算其抑菌率。

1.2.5 拮抗菌株的防效試驗 種子消毒處理完后，待用。制備尖鐮孢黃瓜專化型枯萎病菌孢子懸液：250 mL錐形瓶中加入50 mL PDA液體培養基，接種病原菌，在180 r/min、28℃條件下培養7 d后，用滅菌紗布過濾孢子懸液，再用無菌水稀釋，直到濃度為1×107CFU/mL。拮抗菌株發酵液的制備：將菌株在優化條件下搖瓶發酵，用無菌水稀釋濃度至1×108CFU/mL。

1.2.5.1 室內防效試驗 種子培養皿發芽試驗處理：CK1：無菌水；CK2：尖鐮孢黃瓜專化型枯萎病菌孢子懸液；T1：拮抗菌株發酵液；T2：黃瓜枯萎病原菌孢子懸液+拮抗菌株發酵液，CK1、CK2和T1處理用尖鐮孢黃瓜專化型枯萎病菌分別浸種30 min，T2處理是先用病原菌孢子懸液浸種30 min，然后用拮抗菌株發酵液浸種30 min。取直徑9 cm的培養皿，用無菌雙層濾紙覆蓋培養皿底部并注入5 mL無菌水潤濕，每皿均勻地放入10粒種子，每個處理重復3次［13］。將處理后的培養皿放入設置為濕度60%，光照/黑暗（16 h/8 h）的光照培養箱內。3 d后，測定發芽率、發病率；7 d后，計算活力指數。發芽率（%）=（發芽的種子數/供試種子數）×100，發病率（%）=（發病的種子數/供試種子數）×100，活力指數=（根長+莖長）×發芽率［14］。

1.2.5.2 盆栽防效試驗 將消毒、催芽后的種子播種于裝有滅菌基質的育苗缽中，待植株長至兩葉一心時，挑選長勢較一致的植株，灌根接種處理液30 mL。處理1：黃瓜枯萎病原菌孢子懸液，處理2：尖鐮孢黃瓜專化型枯萎病菌孢子懸液+拮抗菌株發酵液。每處理10盆，隨機排列。在灌根后第15天調查和記錄各個處理的病株數、發病癥狀，計算發病率、病情指數和防治效果，病情指數及防病效果的計算參考呂恒［15］的方法。病情指數（%）= ∑（各級病株數 × 相對級數值）/（調查總株數 × 最高病級代表值）× 100；防治效果（%）=（空白對照病情指數 - 處理區病情指數）/對照組病情指數× 100。

1.2.6 數據分析 選擇SPSS Statistics 17.0軟件進行數據統計分析及鄧肯氏新復極差法進行差異顯著性檢驗；Origin 8.0軟件用于繪圖；16S rRNA序列分析和系統發育樹構建采用MEGA 7.0軟件；響應面試驗設計選用Design-Expert 8.0軟件。

2 結果

2.1 蚯蚓糞中拮抗細菌的分離純化

利用稀釋平板法，共分離純化到352株細菌，運用平板對峙法對這352株細菌進行枯萎病菌抑制性試驗，其中56株細菌對尖鐮孢黃瓜專化型枯萎病菌有抑制作用。重復試驗獲得9株對尖鐮孢黃瓜專化型枯萎病菌明顯抑制作用的拮抗菌（編號為WQ1-9）。其中WQ-5在6 d、9 d和12 d時的抑菌直徑和抑菌率均高于其他拮抗菌。同時WQ-5對尖鐮孢西瓜專化型枯萎病菌和尖鐮孢甜瓜專化型枯萎病菌也具有明顯的抑制作用，抑菌率分別是51.48%和41.74%（6 d），故將菌株WQ-5作為后續研究目標（表2，圖1）。

表2 9株細菌對尖鐮孢黃瓜專化型枯萎病菌抑制作用的篩選結果

圖1 菌株WQ-5對尖鐮孢黃瓜專化型枯萎病菌的拮抗作用

2.2 拮抗菌WQ-5的鑒定

2.2.1 菌株WQ-5培養形態特征及生理生化特征 菌株WQ-5在LB平板上培養24 h，其菌落形狀接近圓形且邊緣不規則，菌落表面干燥、粗糙（圖2-A）。鏡檢后發現，菌株WQ-5是革蘭氏陽性細菌，形態呈桿狀，且產芽孢（圖2-B），結合菌株WQ-5的生理生化測定（表3），初步鑒定拮抗菌WQ-5為芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）。

表3 WQ-5菌株的生理生化實驗結果

圖2 菌株WQ-5在LB平板培養基（A）及光學顯微鏡下（B）的形態特征

2.2.2 16S rRNA 基因分子鑒定 將菌株WQ-5基因序列（1 423 bp）提交至GenBank 數據庫進行BLAST相似性比對，登錄號為MN736614，并構建系統發育進化樹。結果顯示，菌株WQ-5與Bacillus amyloliquefaciens一致性達到100%（圖3），生理生化指標也與之相符，故菌株WQ-5被鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

2.3 菌株WQ-5的培養條件優化

圖3 菌株WQ-5基于16S rRNA基因序列的系統發育進化樹

2.3.1 發酵培養基組分單因素試驗 當基礎培養基內的碳源被果糖代替后，菌株WQ-5的生長量高于其他組，OD600為2.170；當氮源替換為酵母粉時效果最好，菌株WQ-5的OD600為2.341；當無機鹽使用硫酸鎂時，顯著提高了菌株WQ-5的生長量（圖4）。因此，選用果糖+酵母粉+硫酸鎂作為優化培養基組分。

圖4 不同碳源（A）、氮源（B）和無機鹽（C）對菌株WQ-5生長量的影響

2.3.2 發酵條件單因素試驗 發酵條件優化結果如圖5所示。整體來看，對所有發酵因素而言，菌體生長量呈現“正態分布”特征，即“兩頭低，中間高”，說明每個發酵因素均存在一個最適條件。當pH為6.0時，生長量最高（圖5-A）。因此，以6.0為最適初始pH；當搖床轉速為210 r/min時菌體生長量最大。繼續增大搖床轉速，菌體自溶，菌體生長量下降。因此，選擇210 r/min作為菌株WQ-6的最適搖床轉速（圖5-B）。對WQ-5進行梯度溫度培養，結果表明菌株生長量在溫度為33℃時獲得最大值（圖5-C）。菌株WQ-5在裝液量為30%時，生長量最大。因此選擇30%作為菌株WQ-5的最適裝液量（圖5-D）。菌株WQ-5的接種量在1%-4%之間，其菌體量隨接種量的增大而增加，4%時菌體量最大。因此選擇4%作為菌株WQ-5的最適接種量（圖5-E）。

2.3.3 響應面試驗結果 利用中心組合試驗設計，在單因素基礎上進一步優化發酵條件，以裝液量、酵母粉用量和pH為響應變量，OD600為響應值，進行響應面試驗（表4），回歸分析結果如表5。得到回歸方程：Y=2.16-0.14A-0.09B-0.069C-0.047AB-0.042AC+0.091BC-0.27A2-0.32B2-0.32C2。回歸模型系數顯著性檢驗結果表明：因素A、B對菌株的生物量影響極顯著（P＜0.01）；因素C、BC影響顯著（P＜0.05），AB、AC影響不顯著（P＞0.05）；A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），證明試驗各因素與響應值間的關系不是簡單的線性。

2.3.4 最佳條件的確定及驗證實驗結果 響應面圖和等高線圖反映了pH、裝液量和酵母粉用量3個因素的交互作用對菌體量的影響。等高線形狀密集成橢圓形，響應面坡度越陡、表示兩因素的交互作用越顯著，而圓形表示不顯著［16］。如圖6所示，酵母粉用量與裝液量對OD600的交互作用顯著（P＜0.05），pH與酵母粉用量和pH與裝液量之間的交互作用不顯著（P＞0.05），與方差分析結果一致。在上述模型的基礎上，計算回歸方程的極值（Design Expert 8.0軟件），由二次多項回歸方程得出3個因素的最佳值分別是裝液量38.6%、pH 5.8和酵母粉用量18.9 g/L。在上述條件下，預測的OD600的最大值為2.185。在最佳培養條件下進行3次平行實驗，獲得OD600的平均值為2.214，接近于預測值，該模型可以良好地反映菌株WQ-5實際的發酵情況。

圖5 不同初始pH（A）、轉速（B）、溫度（C）、裝液量（D）和接種量（E）對菌株WQ-5生長量的影響

表4 Central Composite Design試驗設計與結果

2.4 優化前與優化后菌株WQ-5對尖鐮孢黃瓜專化型枯萎病菌的抑制作用

將菌株WQ-5在斜面培養基上活化后分別接種到不同的發酵培養基（未優化/優化）中開始發酵試驗。與優化前進行對比，抑菌直徑和抑菌率分別提高了24.8%和抑菌率30.39%（圖7）。

2.5 拮抗菌株對尖鐮孢黃瓜專化型枯萎病菌的防效試驗

2.5.1 室內防效試驗 如圖8所示，菌株WQ-5發酵液處理黃瓜種子的根長、莖長和VI指數明顯高于清水（CK1）和病原菌（CK2）對照，同時降低了發病率。與病原菌對照（CK2）處理相比，T2處理的種子發芽率由20%提高到50%，發病率由20%降低到0，種子的根長、莖長和活力指數分別由68.47 mm、23.21 mm和18.34%提 高 到73.26 mm、27.65 mm和50.45%，提高了7.0%、19.09%和175.14%。綜合以上，拮抗菌株WQ-5可以有效降低種子發病率并提升發芽率，同時使種子的根、莖加速生長，且提高了活力指數。

表5 回歸模型方差分析結果

圖6 各因素交互作用的響應面與等高線圖

2.5.2 盆栽防效試驗 盆栽防效試驗結果表明菌株WQ-5在溫室條件下能有效地防治尖鐮孢黃瓜專化型引起的黃瓜枯萎病的發生（表6）。培養15 d后，對照組幼苗的發病率達到74%，施加WQ-5 菌液處理組發病率為38%，病情指數下降48.65%，防治效果為51.67%，因此拮抗菌WQ-5有較好的生防潛力。

圖7 發酵條件優化處理對菌株WQ-5抑菌直徑和抑菌率的影響

3 討論

近年來，芽孢桿菌屬因能耐受高溫、強紫外線和干旱等極端環境已成為理想的生防菌篩選對象［17］。芽孢桿菌屬被研究用來作為生防菌劑防治植株病害的菌種有很多，被報道比較多的是枯草芽孢桿菌（B.subtilis）［18］、解淀粉芽孢桿 菌（B.amyloliquefaciens）［19］、多 粘 芽 孢 桿 菌（B.polymyxa）［20］和蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）等［21］。本實驗室從蚯蚓堆肥中分離篩選獲得一株解淀粉芽孢桿菌WQ-5，平板對峙試驗試驗和防效試驗結果表明WQ-5對黃瓜枯萎病具有較強的抑制作用。

圖8 菌株WQ-5發酵液對黃瓜種子根長（A）、莖長（B）、活力指數（C）、發芽率和發病率（D）的影響

表6 菌株WQ-5對尖鐮孢黃瓜專化型枯萎病菌的盆栽防效

代謝產物是生防菌發揮生物防治作用的重要物質基礎，其產量的高低直接影響生防菌株的應用效果［22］。發酵是獲得大量微生物活性代謝產物的基礎，不同的培養基營養成分和發酵條件可顯著影響微生物細胞的生命活動，進而影響菌株代謝產物的產率［23］。許多研究表明，優化生防菌培養液組成成分和培養條件，可以促進菌體的生長量增加，并提高抗菌活性物質的產量及防效［22，24］。關于生防菌株解淀粉芽孢桿菌發酵工藝優化的研究報道很多：如梁艷瓊等［25］對解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）JNC2菌株的發酵條件及最適發酵培養基成分進行優化，優化后的發酵條件為初始pH 6.0，發酵溫度34℃，轉速200 r/min，裝液量為60 mL/250 mL，接種量7%，發酵時間72 h［25］；最佳培養基為蛋白胨0.4%，酵母粉0.8%，木糖2%，氯化銨0.6%，硫酸鎂0.2%，優化后發酵濾液的抑菌活性顯著提高了32.61%［25］；盧彩鴿等［26］針對番茄灰霉病菌篩選獲得的菌株MH71的最佳產抗菌物質的培養基組份為玉米粉36.6 g/L，葡萄糖14 g/L，牛肉膏3.2 g/L，蛋白胨7 g/L，碳酸鈣8 g/L，氯化鈉1.33 g/L，K2HPO40.8 g/L和MgSO40.4 g/L［26］；最適發酵條件為發酵溫度30℃，轉速200 r/min，起始 pH 7.0，接種量3%，裝液量100 mL/500 mL，發酵時間為72 h，優化后菌株的抑菌活性提高了37.4%［26］。李娟等［27］采用單因素試驗和正交試驗優化解淀粉芽孢桿菌LJ1發酵工藝，優化后的搖瓶發酵條件為溫度30℃，初始pH 5，轉速200 r/min，裝液量50 mL/250 mL；優化后的發酵培養基為馬鈴薯200 g，黃豆粉20 g，蔗糖10 g，氯化鎂1.5 g，蒸餾水1 000 mL［27］。優化后的菌株LJ1發酵液對Botrytis cinerea盆栽實驗防效達51.08%。由此可以看出，不同菌株所需的養分組成和發酵條件存在差異，可能是菌株的來源不同和菌株本身的生物學特性，每個菌株都有其獨特的營養需求和生長條件，所以其發酵工藝不能一概而論，但經發酵工藝優化后的菌株其生防效果較之前均有提高，所以需選擇選擇適合菌株自身生長的培養基成分和發酵條件。

響應面分析法通過局部試驗回歸擬合因素與結果間的全局函數關系，得到準確有效的試驗結論，能在整個考察區域上確定各個因素的最佳組合及最優響應值，可信度高［28-29］。當前，采用響應面法優化黃瓜枯萎病拮抗菌培養條件的報道較少。本研究以菌株WQ-5的生長量作為考量指標，通過單因素和響應面分析法對菌株WQ-5的培養條件進行了優化，優化后的培養條件明顯促進了菌體生長量，優化后的抑菌直徑和抑菌率較優化前分別提高了24.8%和30.39%。種子發芽和盆栽防效試驗結果表明菌株WQ-5發酵液使種子發病率降低了20%，發芽率提高了150%，種子的根長、莖長和活力指數顯著提高，植株病情指數下降了48.65%，對黃瓜幼苗的防治效果達到了51.67%，說明拮抗菌WQ-5具有較強的生防潛力。但本研究未檢測菌株WQ-5在植株體內不同部位的定殖動態，同時對其防御病害機理未做探究，如其與植株的防御基因表達、酶活性變化等植物誘導抗性的相關關系等，這些問題還需進一步研究，從而全面揭示解淀粉芽孢桿菌WQ-5對黃瓜枯萎病的防治機制。

4 結論

從蚯蚓糞中篩選得到的能有效抑制尖鐮孢黃瓜專化型枯萎病菌的拮抗菌株WQ-5，鑒定為解淀粉芽孢桿菌。使用單因素分析結合響應面分析法優化該菌培養條件后，得到最佳培養條件為果糖30 g/L，酵母粉18.9 g/L，硫酸鎂3 g/L，磷酸氫二鉀1.5 g/L甘油1 g/L，接種量4%，裝液量38.6%，轉速210 r/min，溫度33℃，pH 5.8。與優化前進行對比，菌株WQ-5的抑菌直徑和抑菌率分別提高了24.8%和抑菌率30.39%。防效試驗表明，菌株WQ-5能有效促進種子生長且提高活力指數，降低了黃瓜種子和植株的發病率，使植株的病情指數下降了48.65%，防治效果為51.67%，生防效果良好。