馬尾松根際溶磷細菌Paraburkholderia sp.的篩選、鑒定及溶磷特性研究

呂俊 潘洪祥 于存

（貴州大學林學院，貴陽 550025）

土壤有效磷是農業生態系統中制約植物生長發育的重要限制因子，缺磷會導致植物生長緩慢，產量降低和植株矮小［1-2］。土壤中磷素蘊藏豐富，但主要以難溶性的礦物態磷存在，其主要為Ca-P，難以被植株吸收利用［3］。據全國土壤普查估算，我國約3/2的土壤缺磷，土壤有效態磷僅占全磷量的2%-3%［1］。在生產中，提高土壤磷素的有效性途徑主要是施用化學磷肥，而長期使用化肥會造成土壤板結、保水能力下降以及土壤微生物多樣性和活性降低等一系列生態環境問題［4］。土壤溶磷微生物作為土壤生態系統中的一部分，與難溶性磷活化與轉化有著密切關系，其能在生長代謝中分泌有機酸類物質進而降低局部環境pH值，并與磷酸鹽中的Ca2+、Fe3+、Al3+等金屬陽離子結合，使磷離子被釋放出來，從而提高土壤中有效磷含量，以供植物吸收利用［5］。截止目前，國際公認的溶磷微生物有巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、假單胞菌（Pseudomonas）、農桿菌（Agrobacterium）、腸桿菌（Enterobacter）、黃褐假單胞菌（Cinnamon aeruginosa）等［6-8］。因不同溶磷微生物的生長代謝能力不同，分泌的有機酸種類和數量有很大差異，且不同的有機酸與磷酸鹽中的陽離子的結合能力不一樣，因而不同的溶磷微生物對磷酸鹽的溶解能力有所不同，這是由微生物自身的特性決定的［9］。如劉文干等［10］的研究結果表明Paraburkholderia cepaciaC5-A的溶磷機制主要是通過分泌乙酸，而蕭龍珍等［11］的研究結果表明檸檬酸、乳酸是影響菌株B. megateriumXS2溶磷的重要有機酸。張英等［12］發現不同有機酸促進溶解磷酸三鈣作用基本符合檸檬酸、丁二酸＞草酸、酒石酸、蘋果酸＞乙酸。另外，微生物生長發育以及分泌代謝產物易受外界環境的影響，即使對于同種溶磷微生物，在不同環境因子下（如碳源、氮源、pH和C/N等）也會影響其生長代謝，進而影響溶磷能力［7］。因此，將溶磷菌研發成生物菌肥就得篩選適應不同環境因子的微生物。

馬尾松（Pinus massonianaLamb.）作為我國南方重要的山地造林先鋒樹種和工業用材樹種，其種植面積正逐年增加。在馬尾松幼苗培育過程中，為提高幼苗產量和品質，過量使用無機磷肥已成為了普遍現象，進而導致了馬尾松苗圃土壤理化性質及結構惡化、微生物種群結構失衡、土壤難溶性磷富集，這已嚴重抑制了馬尾松產業的健康發展［13］。雖然已有許多應用外生菌根菌通過溶磷作用對馬尾松促生的研究，但外生菌根菌往往需要在形成菌根之后才能發揮促生作用，另外因其自身特性容易受外界環境影響，進而導致效果受限［14-15］。而根際溶磷細菌通常具有更強的繁殖能力，對環境的要求相對較低，且溶磷能力更強。因此，本研究從馬尾松根際土壤中篩選溶磷細菌，在明確其分類地位的基礎上，研究其在不同培養條件下的溶磷特性以及在不同時期對不同難溶性磷酸鹽的溶解能力，并通過盆栽試驗考察溶磷菌株在土壤中的溶磷效果以及對馬尾松幼苗的促生能力，為開發溶磷微生物肥料提供優質菌株資源，為溶磷菌的科學應用和維持馬尾松產業可持續發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試種子：從貴州省都勻馬尾松國家林木良種基地收集馬尾松（Pinus massonianaLamb.）種子。

土壤樣品：2019年5月于貴陽市花溪區選擇一片生長良好的馬尾松林（26.44° N，106.65° E），從中隨機取5棵林齡為20年左右的健康馬尾松收集其根際土壤。采樣時，鏟去馬尾松表層土，深挖30 cm左右后截取馬尾松根系（根系直徑＜0.5 cm）5段，抖落根系外圍土，再用毛刷將粘在根上的根際土壤（根附近2 mm范圍內）收集于無菌袋中，裝入冰盒內帶回實驗室分離。

解無機磷培養基：葡萄糖10.0 g，硫酸銨0.5 g，氯化鈉0.3 g，氯化鉀0.3 g，七水合硫酸亞鐵0.03 g，四水合硫酸錳0.03 g，七水合硫酸鎂0.3 g，磷酸三鈣10.0 g，蒸餾水1 000.0 mL，pH 7.0-7.2；用于解磷微生物菌株的分離和篩選。LB培養基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉 10.0 g，蒸餾水1 000.0 mL，pH 7.0-7.2；用于菌株的純化和種子液培養。上述培養基添加2.0%的瓊脂即得到相應的固體培養基，在濕熱滅菌鍋121℃高壓滅菌30 min備用。

1.2 方法

1.2.1 溶磷菌的分離 稱取根系土壤采用稀釋涂布平板法依次配備濃度為10-3、10-4、10-5的土壤稀釋液，分別取0.1 mL均勻涂布于無機磷固體培養基上。每個稀釋度重復3次，置于28℃下培養2 d。待菌體長出后挑取四周有明顯透明圈的菌株，于LB固體培養基上采用劃線法進行多次純化直至獲得純培養物，4℃條件下斜面保存，備用。

1.2.2 溶磷菌的篩選 采用三點接種法將1.2.1分離獲得的溶磷菌分別接種于無機磷固體培養基上，28℃下培養5 d后，測量各菌株的透明圈直徑（D）和菌落直徑（d）。每個處理設3次重復，通過計算D/d值的大小初步確定菌株溶磷能力；將初篩得到的溶磷菌接種到盛有50 mL已滅菌LB液體培養基的三角瓶中，28℃下120 r/min搖床培養48 h后，取培養液于8 000 r/min離心10 min棄上清液，無菌蒸餾水洗滌菌體3次后稀釋、調制菌重懸液（菌體量1×108CFU/mL）。250 mL三角瓶中裝入100 mL無機磷液體培養基，121℃條件下高壓滅菌25 min。待冷卻后，將菌懸液（1×108CFU/mL）按2%的接種量接入已滅菌的無機磷液體培養基中，以接入等量滅活菌懸液的培養基作為對照。每個處理設3次重復，28℃下120 r/min搖床培養5 d后，收集培養液于8 000 r/min離心10 min，取上清液采用鉬銻抗比色法測定培養液中有效磷含量［10］。菌株溶磷量為接菌培養液有效磷含量減去對照有效磷含量，用mg/L表示。

1.2.3 溶磷菌的鑒定 細菌的形態學觀察及甲基紅、接觸酶、V-P反應試驗等生理生化指標的測定參照《常見細菌系統鑒定手冊》［16］。菌株DNA提取以及16S rDNA PCR擴增測定參照《精編分子生物學實驗指南》［17］。將擴增產物送到成都新百基生物科技有限公司進行純化測序。將16S rDNA測序結果通過NCBI網站Blast程序與GenBank數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）中核酸序列進行比對分析，并從NCBI中下載與之相似性高的相關基因序列，利用MEGA 7.0軟件采用Neighbor-joining法構建系統發育樹。

1.2.4 溶磷菌對4種難溶性磷酸鹽的溶解效果 在無機磷液體培養基的基礎上，分別以磷酸三鈣Ca3（PO4）2（分析純，P含量19.97%）、磷酸氫鈣CaHPO4·2H2O（分析純，P含量18.10%）、磷酸鐵FePO4·2H2O（分析純，P含量16.60%）和磷酸鋁（分析純，P含量25.40%）為唯一磷源，添加量分別為10.00 g/L、11.03 g/L、12.03 g/L和7.90 g/L，使各培養液中的P含量一致。將待測菌株（1×108CFU/mL）按2%的接種量接入已滅菌的各培養基中，以接入等量滅活菌懸液的培養基作為對照。28℃下120 r/min搖床培養7 d，每隔1 d收集1次培養液離心并測定其溶磷量和pH值，每個處理3次重復。

1.2.5 不同條件對菌株溶解磷酸三鈣的影響 以無機磷液體培養基為基礎，分別設置不同碳源（以葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉作為唯一碳源，添加量分別為10.00、10.00、9.50、9.50和9.00 g/L，使各處理C含量一致）、氮源（以（NH4）2SO4、KNO3、NH4Cl、CO（NH2）2和NH4NO3作為唯一氮源，添加量分別為0.50、0.76、0.41、0.23和0.30 g/L，使各處理N含量一致）、C/N比（葡萄糖濃度為10.0 g/L，（NH4）2SO4添加量分別為1.00、0.40、0.25、0.17 g/L，即C/N比 為10∶1、25∶1、40∶1和60∶1）、NaCl含量（分別設置培養基NaCl終濃度為0、2.5、5、10和20 g/L處理）以及初始pH（用0.5 mol/L鹽酸溶液和0.5 mol/L氫氧化鈉溶液調節培養基初始pH值，分別設置pH為4、5、6、7、8、9、10處理）。按照1.2.4相同操作接菌并培養5 d后，收集各處理下的培養液離心并測定其溶磷量，每個處理3次重復。

1.2.6 菌株對盆栽馬尾松幼苗的促生作用 盆栽試驗的土壤基質來自貴州大學西校區馬尾松林，土壤為鋁質常濕淋溶土。選擇采土點后，去除枯枝落葉層，深挖約20 cm后取樣，于實驗室過篩、滅菌備用。將馬尾松種子浸入30℃溫水浸泡12 h，選取沉入水底的籽粒飽滿、大小均勻的種子，表面消毒采用0.4%KMnO4溶液浸種20-30 min，無菌蒸餾水洗滌5次以上，將種子埋入裝有滅菌蛭石的托盤中，于28℃保溫箱中催芽培養2周，選擇長勢一致的幼苗進行盆栽試驗考察溶磷菌對馬尾松的促生效果。設接種細菌處理，每盆裝土0.5 kg，種植馬尾松3株，接菌量為每盆5 mL菌懸液（108CFU/mL），以接種等量滅活菌懸液的幼苗為對照，每處理設36個重復。生長期間不施肥，馬尾松生長60 d后收獲，測量馬尾松的株高、根長、植株鮮重、干重，測定植株全磷量及根際土壤中有效磷的含量［1］。

1.2.7 數據處理 數據處理及畫圖采用Microsoft Excel 2010軟件進行，采用SPSS 19.0軟件進行獨立樣本t檢驗和單因素ANOVA方差分析，多重比較采用Duncan檢驗，相關性分析采用Pearson法，進化樹采用MEGA 7.0軟件構建。

2 結果

2.1 溶磷菌的篩選

由無機磷固體培養基上初步純化獲得產生明顯溶磷透明圈且形態、顏色不同的菌落20個。其中，溶磷圈直徑（D）與菌落直徑（d）的比值（D/d）≥2.00的菌株有5株（表1）。溶磷菌在固體培養下的D/d與菌株代謝物的種類、釋放快慢、蔓延程度等有關，透明圈法只能作為溶磷菌的初步篩選指標。因此，采用無機磷液體培養基對這5株細菌進行復篩，液體搖瓶培養5 d后的溶磷結果顯示（表1），5株細菌的溶磷量范圍在43.44-244.13 mg/L之間，各菌株間的溶磷能力存在顯著差異，其中以菌株WJ2的溶磷量最高，為244.13 mg/L，顯著高于其他4株菌株。

表1 馬尾松根際溶磷細菌的溶磷能力

2.2 菌株WJ2的鑒定

菌株WJ2在無機磷固體培養基上培養72 h后，菌落呈乳白色，油脂狀，不透明，邊緣整齊，中心凹陷，表面濕潤、光滑（圖1-A）；革蘭氏染色結果表明該菌株屬革蘭氏陰性細菌（圖1-B）；掃描電鏡下的個體形態為短桿狀（圖1-C）；生理生化檢測結果顯示該菌株可以利用α-D-葡糖、D-果糖、D-天冬氨酸等多種碳、氮源，淀粉水解試驗為陰性，接觸酶反應為陽性，葡萄糖發酵產酸產氣，甲基紅反應為陰性，V-P測定為陽性，能產生明膠酶使明膠分解為氨基酸，溫度在40℃時不能生長，NaCl濃度在3%時不能生長（表2）。

利用通用引物27F和1492R引物擴增獲得WJ2的16S rDNA序列的長度為1 352 bp。將該序列進行BLAST比對結果顯示，菌株WJ2的16S rDNA核苷酸序列與Paraburkholderia caffeinilytica（NR152088.1）和P. sediminicola（NR044383.1）的16S rDNA核 苷酸序列同源性最高，分別為99.18%和99.04%。由多個細菌16S rDNA序列構建的系統發育樹可以看出菌株WJ2與外源菌株Arthrobacter paludis不在一個分支，親緣關系較遠，而與多個Paraburkholderiasp.菌株聚為一個分支，表明菌株WJ2與Paraburkholderiasp.屬的親緣關系更近（圖2）。因此，結合菌株WJ2生理生化特性、菌落特征、菌體個體形態以及菌株16S序列的比對結果和系統進化分析，將菌株WJ2鑒定為伯克霍爾德氏菌Paraburkholderiasp.。菌株WJ2的16SrDNA序列提交至GenBank的登錄號為MT065821。

圖1 菌株WJ2的菌落形態、溶磷圈及個體形態

2.3 菌株WJ2對4種難溶性磷酸鹽的溶解動態監測

結果表明菌株WJ2對4種磷酸鹽均有一定的溶解能力，表現出該菌株具有廣譜的溶磷性（圖3）。其中，對磷酸三鈣的溶解量最大，磷酸鋁和磷酸鐵次之，磷酸氫鈣最差，其最大溶磷量分別為204.42 mg/L、177.70 mg/L、151.82 mg/L和108.19 mg/L。此外，Pearson相關分析表明，菌株WJ2分別在磷酸鐵（r=-0.500，P＜0.05）（圖3-A）、磷酸三鈣（r=-0.844，P＜0.01）（圖3-B）、磷酸氫鈣（r=-0.533，P＜0.01）（圖3-C）和磷酸鋁（r=-0.787，P＜0.01）（圖3-D）培養液中的溶磷量與pH變化之間均呈顯著負相關關系。

2.4 碳源種類對菌株WJ2溶磷能力的影響

菌株WJ2在不同碳源中對磷酸三鈣的溶解能力差異顯著（圖4）。以乳糖、葡萄糖為碳源時該菌株的溶磷量最高，分別為252.93 mg/L和244.61 mg/L，顯著高于在其他碳源條件下的溶磷量；以蔗糖為碳源時的溶磷量次之，為197.87 mg/L；以可溶性淀粉為碳源時的溶磷量最低，為20.14 mg/L。這表明該菌株對碳源的利用可能主要以單糖和雙糖為主，對多糖的利用率較低。

2.5 氮源種類對菌株WJ2溶磷能力的影響

不同氮源對菌株WJ2溶解磷酸三鈣的影響差異顯著（圖5）。以尿素為氮源時該菌株的溶磷量最大，為238.19 mg/L；以硫酸銨、硝酸銨為氮源時的溶磷量次之，但與尿素無顯著差異，分別為211.70 mg/L和207.00 mg/L；其次是以硝酸鉀為氮源，溶磷量為160.26 mg/L；以氯化銨為氮源時的溶磷量最低，為100.48 mg/L。

表2 菌株WJ2的生理生化特性

圖2 菌株WJ2及其近緣種的系統進化樹分析

圖3 不同磷源培養液中溶磷量（PSC）和pH的動態變化

圖4 碳源種類對溶磷菌WJ2溶解磷酸三鈣的影響

2.6 C/N比對菌株WJ2溶磷能力的影響

C/N比對菌株WJ2溶解磷酸三鈣的影響結果顯示，培養液中C/N能顯著影響菌株WJ2的溶磷能力，且回歸分析表明兩者間的關系符合線性模型（R2=0.924，P＜0.05）（圖6）。以C/N比 為10∶1時菌株WJ2的溶磷量最大，為283.32 mg/L，顯著高于其他3組C/N比處理；當C/N比為25∶1時的溶磷量次之，為204.70 mg/L；C/N比為60∶1和40∶1時溶磷量最低，分別為74.30 mg/L和84.93 mg/L，且兩者間的差異不顯著。

圖5 氮源種類對溶磷菌WJ2溶解磷酸三鈣的影響

圖6 碳氮比對溶磷菌WJ2溶解磷酸三鈣的影響

2.7 不同NaCl含量對溶磷菌WJ2溶磷能力的影響

不同NaCl濃度對菌株WJ2溶解磷酸三鈣的影響差異顯著，且回歸分析表明兩者間的關系符合線性模型（R2=0.844，P＜0.05）（圖7）。當培養基中NaCl濃度為0 g/L時，菌株WJ2的溶磷量最大，為234.78 mg/L；隨著NaCl濃度的增加，菌株的溶磷量呈下降趨勢，當NaCl濃度分別為2.5 g/L、5 g/L、10 g/L和20 g/L時，其溶磷量依次為141.00 mg/L、105.59 mg/L、54.74 mg/L、2.18 mg/L。

2.8 初始pH對菌株WJ2溶磷能力的影響

圖7 氯化鈉濃度對溶磷菌WJ2溶解磷酸三鈣的影響

菌株WJ2在不同初始pH中對磷酸三鈣的溶解能力差異顯著，且回歸分析表明兩者間的關系符合二次模型（R2=0.807，P＜0.05）（圖8）。當培養基的初始pH為8.0時，菌株WJ2的溶磷量最大，顯著高于其他初始pH處理，為218.33 mg/L；當初始pH為7.0和6.0時，菌株WJ2的溶磷量仍維持在較高水平，分別為183.73 mg/L和177.61 mg/L，僅次于初始pH為8.0的處理；但當初始pH＞8.0和pH＜6.0時菌株WJ2的溶磷能力受到顯著影響，溶磷量發生驟減。表明該菌株適應于在中性偏堿性的環境中進行溶磷活動。

圖8 初始pH對溶磷菌WJ2溶解磷酸三鈣的影響

2.9 盆栽試驗菌株WJ2對馬尾松生長及土壤有效磷的影響

培養60 d后，接種菌株WJ2的馬尾松幼苗與對照相比，其株高、主根長度和鮮重都顯著增加，增加量分別達11.74%、45.73%、46.00%，其干重也增加了33.33%。此外，接種菌株WJ2也顯著提高土壤中有效磷含量和植株磷素含量，與對照比，分別增加了18.32%、13.82%（表3）。表明菌株WJ2能夠提高土壤中有效磷含量，促進馬尾松幼苗的生長。

3 討論

溶磷微生物的溶磷能力主要受自身遺傳特性的影響，不同溶磷微生物的溶磷能力差異很大，溶磷微生物對不同難溶性磷也有選擇性，通常菌株能溶解的難溶性磷源越廣，則說明其溶磷特性越好［18-19］。劉文干等［10］篩選的洋蔥伯克霍爾德氏菌（Paraburkholderia cepacia）對磷酸三鈣、磷酸鐵、磷酸鋁、磷礦粉的溶解量分別為125.79 mg/L、60.02 mg/L、227.34 mg/L和321.15 mg/L。蕭龍珍等［11］篩選得到的巨大芽孢桿菌（B.megaterium）對磷酸三鈣的溶解量為189.20 mg/L。薛冬等［20］從牡丹根際分離到的白網鏈霉菌（Streptomyces albireticuli）在不同磷源培養液中溶磷量依次為磷酸鈣（158.5 mg/L）＞磷酸鋁（139.9 mg/L）＞磷酸鐵（127.7 mg/L）＞卵磷脂（45.6 mg/L）。樊晶晶等［21］在連續監測黑曲霉（Aspergillus niger）溶解磷酸三鈣時，其溶磷量在36 h后達到穩定值，為4.7 mg/L。本研究從馬尾松根際篩選出的伯克霍爾德菌WJ2對磷酸三鈣、磷酸鐵、磷酸氫鈣和磷酸鋁的溶解能力分別達到204.42 mg/L、151.82 mg/L、108.19 mg/L和177.70 mg/L，表現出良好的溶磷能力。由于磷酸三鈣較磷酸鐵、磷酸鋁、磷酸氫鈣相比更易被解離，故多數研究結果表明，溶磷菌對磷酸鈣的溶解能力大于磷酸鋁、磷酸氫鈣和磷酸鐵，這與本實驗得出的結果相似［7，20，22］。此外，大部分研究認為，溶磷菌溶磷過程中的溶磷量和培養液pH間存在顯著相關關系［7，22］。在本研究中，對伯克霍爾德菌WJ2在不同磷源中的溶磷動態進行監測時，發現其在磷酸鐵、磷酸三鈣、磷酸氫鈣和磷酸鋁培養液中的溶磷量與培養液pH呈顯著負相關關系，表明分泌有機酸類物質導致培養液pH值的下降可能是該菌株溶解難溶性磷酸鹽的重要因素之一。

表3 菌株WJ2對馬尾松生長及土壤有效磷的影響

因碳、氮源作為微生物的能源物質，其種類會影響溶磷微生物的生長代謝，進而影響其溶解磷酸鹽的能力［23］。故本研究設置了不同碳源、氮源探究伯克霍爾德菌WJ2的溶磷特性，結果表明其在以乳糖、葡萄糖為碳源和尿素、硫酸銨、硝酸銨為氮源時均能正常利用并發揮較好的溶磷能力。這與喬志偉等［22］和蕭龍珍等［11］的結果相似。同時，溶磷菌的溶磷能力也受碳氮比的影響，且通常碳氮比越低，菌株的溶磷能力越強［23］。在本研究中，隨著培養基碳氮比的降低，菌株WJ2對磷酸三鈣的溶解能力隨之增強，在碳氮比為10∶1時，溶磷量達到了最大值。不同溶磷微生物溶解難溶性磷酸鹽所需最適初始pH值有所不同，pH過高或過低都影響溶磷能力。Zeng等［5］的研究表明，中性環境更有利于弗雷德里克斯堡假單胞菌（Pseudomonas frederiksbergensis）溶解磷酸鹽。李豆豆等［7］發現，初始pH為7-8時更適宜草酸青霉菌PSF1的生長，同時溶磷能力最強。本研究中，菌株WJ2在初始培養液pH值為8時的溶磷能力最高，隨著初始pH的升高或降低，其溶磷能力會隨之降低。此外，大部分研究表明，溶磷菌的溶磷能力在一定程度上會隨著培養液NaCl的含量增加而降低，這與本實驗得出的結果相似［5］。溶磷微生物能活化土壤中難溶性磷，提高土壤中有效磷水平，進而提高植物對磷素的吸收率并促進其生長［19，24-26］。在本實驗中，接種伯克霍爾德菌WJ2的馬尾松幼苗與對照相比，其株高、主根長、鮮重等生物量均得到顯著提高，以及植株磷素含量、根際土壤有效磷含量也顯著增加。

4 結論

從馬尾松根際篩選到一株高效溶磷細菌，鑒定為伯克霍爾德菌WJ2。該菌株對磷酸三鈣、磷酸鋁、磷酸鐵和磷酸氫鈣等多種難溶性磷酸鹽有較好的溶磷能力；菌株WJ2在以乳糖、葡萄糖作為碳源，尿素、硫酸銨、硝酸銨等作為氮源、在C/N為10∶1、NaCl含量為0 g/L、pH為8.0的條件中都能表現出較強的溶磷能力；在盆栽試驗中，菌株WJ2可提高土壤有效磷含量，促進植株對磷素的吸收，促進馬尾松幼苗的生長。