不同地區藥用植物兩面針根際土壤真菌種群多樣性差異分析

張淼 陳裕鳳 陳龍 黃飄玲 韋露玲

（廣西中醫藥大學，南寧 530200）

植物根際是植物與土壤生態系統進行物質交換的主要場所［1］。1904年，德國微生物學家Lorenz Hiltner首次提出了根際這一概念［2］，他將根際定義為根系周圍、受根系生長影響的土體。根際微生物作為該土體的一種特殊生物群體，與植物根系相互作用形成了“植物-微生物-土壤”這一根系微生態系統［3-6］。根際微生物參與了植物根系與土壤環境的物質能量代謝，并影響了根際土壤的理化性質和植物根系的發育與生長，進而影響了植物類藥材的品質［7-9］。因此，探討不同生態環境下兩面針植物根際土壤酸度、有機質含量、土壤機械組成、真菌的物種多樣性的差異以及環境因子對真菌菌群結構間的影響作用，對開展兩面針藥材種植有重要意義。

本研究以中國傳統中藥兩面針藥材原植物為研究對象，研究不同產地兩面針植物根際土壤真菌種群多樣性的差異，并分析土壤酸堿度、有機質含量，土壤機械組成等環境因子與其相關性，旨為兩面針藥材在不同地域的生長發育差異和種植研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究在2019年4-5月間分別從廣西南寧、廣西玉林、廣東廣州、廣西賀州、福建福州、福建寧德等地采集植株大小相近、長勢良好的野生幼小兩面針Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC.植物根際土壤。土壤采集方法以田間根際土壤樣品采集方法［10］為基礎，結合實際研究情況進行了改良，即采集植物根系周圍半徑≤5 mm，深度≤30 cm范圍內的土壤，除去雜質，混合均勻后作為研究樣品，放入冰袋內，運回實驗室保存至4℃冰箱備用。每份土壤樣品分成2份，1份用于DNA提取和測序，另一份用于土壤PH、有機質含量和土壤質地檢測（表1）。

表1 采樣地地理信息

1.2 方法

1.2.1 土壤樣品PH、有機質含量和土壤質地檢測 土壤樣品PH的測定依據中國農業行業標準（NY/T 1377-2007）中土壤PH的測定方法進行測定。土壤有機質含量測定依據中國農業行業標準（NY/T 1121.6-2006）中土壤檢測第6部分：土壤有機質的測定方法進行測定。土壤質地測定依據中國林業行業標準（LY/T 1225-1999）中森林土壤顆粒組成（機械組成）測定方法的吸管法進行機械組成測定并確定土壤質地名稱。

1.2.2 土壤樣品基因組DNA提取 參照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒使用說明書進行土壤樣品DNA的提取。將提取的基因組DNA在瓊脂糖凝膠上檢測其完整性和濃度。利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，以確定PCR反應應加入的DNA量。

1.2.3 土壤樣品真菌ITS1-ITS2區域測序及多樣性分析 選擇真菌核糖體內轉錄間隔區（ITS）的ITS1-ITS2區域作為擴增區域。利用Illumina Miseq雙端測序（2×300 bp）法測序。PCR所用的引物融合了測序平臺的ITS1-ITS2通用引物。ITS1F引物為5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'；ITS2R引物為5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'。Miseq測序獲得數據后首先去除引物接頭序列，在根據PE reads之間的overlap關系，將成對的reads拼接（Merge）成一條序列，然后按照barcode標簽序列識別并區分樣品，得到各樣本數據，對其進行質控過濾，再利用Usearch去除非特異性擴增序列和嵌合體序列，得到各樣本最終有效數據。對獲得的各樣品有效數據進行操作單元分類（Operational Taxonomic Units，OTU），并在此基礎之上進行聚類分析、物種多樣性和物種分類分析。樣品宏基因組測序及數據處理委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.4 真菌多樣性與土壤環境因子的相關性分析 基于97%相似性水平的樣品OTU分類，進行去趨勢對應分析（Detrended Correspondence Analysis，DCA），確定開展環境因子、土壤樣品、真菌菌群結構三者間相關性研究的分析模型即冗余分析（Redundancy analysis，RDA）或典范對應分析（Canonical correspondence analysis，CCA）分析，進而進行三者的相互關系研究［11］。

2 結果

2.1 土壤樣品pH、有機質含量和土壤質地檢測結果

6個產地兩面針根際土壤樣品的測定結果如表2所示。從表2可知，6個產地土壤樣品除A1樣品pH=7.7，顯中性外，其余5個樣品pH均小于7，顯酸性。按pH從大到小排列，6個樣品的pH排序為A1＞A3＞B3＞B2＞A2=B1。有機質含量以A1樣品最高，B3樣品最低。粘粒粒級含量A1最高，A3最低。砂粒粒級含量A3最高，A1最低。粉（砂）粒粒級含量B2最高，A3最低。6個樣品中除A3樣品為砂質黏壤土外，其余5個樣品土壤質地均為黏土。

表2 土壤樣品PH、有機質含量和土壤質地檢測結果

2.2 測序結果質量分析

對6個產地兩面針植物根際土壤樣品進行高通量測序，利用Usearch軟件（Version5.2.236）和Uchime軟件（Version4.2.40）及數據庫BLASTN比對，對測序數據進行質控，剔除非擴增序列、細胞器組織序列、嵌合體（Chimera）及靶區域外序列后得到各產地樣品的有效reads數目，A1樣品78 040條、A2樣品79 006條、A3樣品97 001條、B1樣品57 426條、B2樣品65 988條、B3樣品31 417條。

2.3 OTU分析結果

利用Usearch軟件（Version：5.2.236），在相似性≧97%的水平上對各樣品的有效序列進行OTU聚類，篩選出OTUs的代表性序列，并利用R制作韋恩圖（圖1）。6個土壤樣品分別檢測到的OTU單元數為620個（A1）、1 555個（A2）、933個（A3）、971個（B1）、1 106個（B2）、1 060個（B3）。從圖1可知，6個樣品所含OTU數目均由特異OTU數目和共有OTU數目組成，重疊區包含18個共有OTU數目。各樣品所含特異OTU數目以A2最多，A1最少。稀釋性曲線（Rarefaction Curve）顯示各樣品測序數據量合理。基于6個樣品的OTU豐度，使用非加權組平均法（UPGMA）構建樣本聚類樹圖，A1和A3可聚為一類，B2和A2可聚為一類，如圖2所示。A1和A3的相似度高于B2和A2。

圖1 6個土壤樣品的OTU韋恩圖

圖2 基于OTU的6個樣本聚類樹圖

2.4 土壤真菌物種多樣性分析

2.4.1 樣品Alpha多樣性分析 本研究6個樣品的Alpha多樣性分析中Chao1指數和ACE指數反映樣品群落豐富度（Community richness）；Shannon指數和Simpson指數反映樣品群落多樣性（Community diversity）。覆蓋度Coverage均大于99%，說明測序結果能夠代表樣品的真實情況。6個土壤樣品中Chao1指數的大小順序為A2（1651.24）＞B2（1225.25）＞B1（1046.63）＞B3（1066.68）＞A3（956.25）＞A1（631.51）；ACE指數 的大小順序為A2（1701.71）＞B2（1273.95）＞B3（1072.21）＞B1（1078.92）＞A3（960.36）＞A1（642.53）；兩者反映土壤真菌豐度趨勢相同，A2樣品最高，B2次之，A1最低。6個土壤樣品的Shannon指數分別為：A1樣品3.302695、A2樣 品4.395274、A3樣 品4.943063、B1樣 品3.306774、B2樣品4.09175、B3樣品5.577571；Simpson指 數 分 別 為：A1樣 品0.118144、A2樣品0.050758、A3樣品0.015423、B1樣品0.116719、B2樣品0.054879、B3樣品0.011545。

2.4.2 Rank-abundance曲 線 分 析 Rank-abundance曲線在橫軸上越寬，表示物種的組成越豐富；曲線形狀越平坦，表示物種組成的均勻程度越高。從圖3可以看出，6個土壤樣品的橫坐標長度均一致，均比較平坦，說明6個土壤樣品的物種組成都比較豐富，物種組成的均勻程度也較高。

2.5 土壤真菌物種分類分析

圖3 不同土壤樣品的Rank-abundance曲線

利用blastn將OTU序列與對應數據庫進行比對，篩選出OTU序列的最佳比對結果，并對比對結果進行過濾，默認滿足相似度＞90%且coverage＞90%的序列被用來后續分類，不滿足條件的序列則被歸為unclassified。6個土壤樣品在各個層級上的物種分類結果見表3。A2樣品在各個層級上的物種分類最多，A1樣品的物種分類最少。

表3 6個土壤樣品各個層級物種分類結果統計表

根據物種分類結果，使用統計學方法進行土壤菌群結構分析，并利用R制作物種菌落結構組分圖，觀測各樣品菌落結構。在門分類水平上，6個土壤樣品真菌群落組成見圖4。研究發現，6個土壤樣品的真菌主要分屬子囊菌門Ascomycota、擔子菌門Basidiomycota、被孢霉門Mortierellomycota、羅茲菌門Rozellomycota、壺菌門Chytridiomycota、球囊 菌 門Glomeromy-cota、unclassified、unclassified_Fungi等8個門類，各樣品間存在明顯差異。A1樣品中子囊菌門Ascomycota和unclassified占比較高，分別為41.02%和52.17，為其優勢菌門。A2樣品中子囊菌門Ascomycota、擔子菌門Basidiomycota、unclassified、和被孢霉門Mortierellomycota占比較高，分 別 為42.66%、18.4%、11.47%和24.38%，為其優勢菌門。A3樣品中子囊菌門Ascomycota、unclassified和羅茲菌門Rozellomycota占比較高，分別為57.96%、18.79%和10.86%，為其優勢菌門。B1樣品中羅茲菌門Rozellomycota、擔子菌門Basidiomycota和子囊菌門Ascomycota占比較高，分別為50.19%、25.31%和14.31%，為其優勢菌門。B2樣品中子囊菌門Ascomycota和擔子菌門Basidiomycota占比較高，分別為66.49%和23.63%，為其優勢菌門。B3樣品中子囊菌門Ascomycota和unclassified占比較高，分別為55.58%和23.83%，為其優勢菌門。

圖4 phylum水平所有樣本群落結構分布圖

在屬分類水平上，本研究對6個土壤樣品的菌落組成進行了研究。并對樣品物種分類中豐度占比最高的前50個物種分類的分布情況進行大小排序，剩余物種的分類合并成other。從圖5可看出，A1樣品相對豐度排名前5的菌屬分別為未分類菌屬unclassified52.17%、綠僵菌屬Metarhizium16.07%、其他菌屬other5.29%、鐮刀菌屬Fusarium4.57%、子囊菌門未分類菌屬unclassified_Ascomycota3.9%。A2樣品為為分類的被孢霉目未分類菌屬unclassified_Mortierellales15.37%、其 他 菌 屬other14.76%、Saitozyma12.46%、未分類菌屬unclassified11.47%、Archaeorhizomyces9.48%。A3樣品為其他菌屬other20.74%、未分類菌屬unclassified18.79%、unclassified_Rozellomycota10.51%、毛殼科未分類菌屬unclassified_Chaetomiaceae6.48%。B1樣品為被孢霉屬Mortierella49.91%、環柄菇屬Lepiota13.33%、其他菌屬other8.84%、未分類菌屬unclassified8.78%、硬皮馬勃屬Scleroderma2.55%。B2樣品為Saitozyma16.2%、青霉菌Penicillium15.32%、其他菌屬other12.53%、曲霉屬Aspergillus9.69%、未分類菌屬unclassified7.39%。B3樣品為其他菌屬other26.02%、未分類菌屬unclassified23.83%、煤炱目未分類菌屬unclassified_Capnodiales5.98%、柔膜菌目未分類菌屬unclassified_Helotiales5.62%、刺盾炱目未分類菌屬unclassified_Chaetothyriales3.89%。

圖5 genus水平所有樣本群落結構分布圖

熱圖中每一列代表一個樣本，行代表群落結構，菌落分布豐度值可通過顏色深淺來反映變化情況，從而直觀反映種水平上群落分布組成的異同。為了展示效果，只顯示豐度最高的前50個物種分類信息，剩余的物種分類合并成other。以種分類水平為例，圖6為6個樣品在種水平的物種豐度熱圖，顏色塊代表相對物種豐度值，顏色越紅表示相對豐度越高，顏色越藍反之。與此同時，熱圖對樣本做了聚類，樣本菌群分布越類似則樣本距離越近，聚類樹中的位置越靠近。從圖5可以看出，除未分類種（unclassified）和其他菌種other外，只有子囊菌門菌種Ascomycota_sp和真菌Fungi_sp兩個真菌菌種均具有較高豐度。而其他真菌只在部分樣品中表現出較高豐度，如Saitozyma_podzolica、長穗被孢霉菌Mortierella_elongata、鐮刀霉菌Fusarium_sp、假球殼目菌Pleosporales_sp、粗糙孔菌屬Trechispora_sp等。在差異性方面，6個樣品真菌菌種豐度整體差異較大，在個別菌種豐度上也呈現出特有性。A1樣品中金龜子綠僵菌Metarhizium_anisopliae真菌的豐度明顯高于其他樣品。A2樣品中被孢霉屬Mortierellales_sp、庫氏被孢霉Mortierella_kuhlmanii、珊瑚菌科Clavariaceae_sp、曲線頸槽蛇菌Gliocladiopsis_curvata真菌的豐度明顯高于其他樣品。A3樣品中生赤殼菌科菌Bionectriaceae_sp、座囊菌綱菌Dothideomycetes_sp、唐菖蒲青霉Penicillium_gladioli、尼泊爾枝頂孢Acremonium_nepalense、孔氏青霉菌Penicillium_kongii、癬 囊 腔 菌Plectosphaerella_cucumerina真 菌的豐度明顯高于其他樣品。B1樣品中火焰環柄菇屬Lepiota_flammeotincta、類變形被孢霉Mortierella_amoeboidea、Trechisporales_sp真菌的豐度明顯高于其他樣品。B2樣品中Allophoma_tropica、熱帶節擔菌屬Wallemia_tropicalis真菌的豐度明顯高于其他樣品。B3樣品中分支裂孔菌Cladophialophora_sp、煤炱目Capnodiales_sp真菌的豐度明顯高于其他樣品。

2.6 土壤真菌菌群與土壤理化因子的RDA分析

本研究將6個土壤樣品的酸堿度（PH）、有機質（ORM）、海拔（HT）、土壤粘粒（CP）、土壤砂粒（SP）、土壤粉（砂）粒（SSG）等因子作為環境因子，結合樣品OUT聚類結果進行RDA分析，其結果如圖7所示。從圖中各環境因子箭頭與樣品-中心連線的夾角可以看出，A1樣品與酸堿度（PH）、有機質（ORM）、土壤粘粒（CP）夾角為銳角，呈正相關；與土壤砂粒（SP）、土壤粉（砂）粒（SSG）為鈍角，呈負相關。A2和B2樣品則與A1樣品相反。A3和B3樣品與酸堿度（PH）、有機質（ORM）、土壤粘粒（CP）、土壤砂粒（SP）、土壤粉（砂）粒（SSG）均為銳角，呈正相關。B1樣品與有機質（ORM）、土壤粘粒（CP）為銳角，呈正相關；與其他因子為鈍角呈負相關。通過各樣品對各環境因子的箭頭連線作投影，其投影點距箭頭的距離可以用于評價該環境因子對樣品菌群的影響。從圖7可以看出，各環境因子對A1樣品的影響程度的大小順序為：有機質含量（ORM）＞土壤粘粒（CP）＞土壤粉（砂）粒（SSG）＞酸堿度（PH）＞土壤砂粒（SP）。對A2樣品的影響程度的大小順序為：土壤粉（砂）粒（SSG）＞土壤砂粒（SP）＞有機質含量（ORM）＞土壤粘粒（CP）＞酸堿度（PH）。對A3樣品的影響程度的大小順序為：土壤粉（砂）粒（SSG）＞土壤砂粒（SP）≈有機質含量（ORM）＞土壤粘粒（CP）＞酸堿度（PH）。對B1樣品的影響程度的大小順序為：有機質含量（ORM）＞土壤粘粒（CP）＞土壤砂粒（SP）＞土壤粉（砂）粒（SSG）＞酸堿度（PH）。B2樣品受環境因子的影響與A2一樣，B3樣品受環境因子的影響與A3一樣。而海拔（HT）因子未表現出對樣品真菌種群有影響。

3 討論

根際土壤真菌作為“植物-土壤-微生物”這一根際微生態系統中的關鍵參與者［12］，其在維持根際微生態系統穩定、協同植物及其內生菌促進植物生長發育、營養物質的攝取與輸布、代謝調節和抗病蟲害等發揮有重要的調節作用［3，13］。本研究分別從兩面針主產區廣東、廣西、福建等地采集了6份兩面針根際土壤樣品，利用分子生物學和高通量測序技術對各產地的根際土壤真菌種群多樣性進行研究，并通過冗余分析（Redundancy analysis，RDA）研究了土壤真菌菌群與環境因子的相關性分析。研究結果表明，6個實驗樣品真菌種群多樣性豐富。在真菌種群結構上，不同產地土壤樣品中真菌物種組成雖有一定的相似性，但其差異性非常明顯，尤其在物種豐度上。環境因子土壤酸堿度（PH）、有機質含量（ORM）、土壤粘粒（CP）、土壤砂粒（SP）、土壤粉（砂）粒（SSG）等對樣品真菌菌群組成和物種豐度均有不同程度的影響。但與海拔（HT）因子無關，其可能與海拔對根際土壤微生態體系中酶活性的空間變異程度的影響有關［14］。

圖6 6個樣品在門、綱、目、科、屬、種的物種豐度熱圖

圖7 各土壤樣品真菌菌群與土壤理化因子的RDA分析2D圖和3D圖

從物種分類學來看，兩面針根際土壤真菌種群中90%以上的真菌來自于子囊菌門Ascomycota、unclassified、擔子菌門Basidiomycota、被孢霉門Mortierellomycota和羅茲菌門Rozellomycota。子囊菌門Ascomycota真菌在各樣品真菌種群的占比較高，其中在B2樣品中占比最高，達到了66.49%，其次是A3和B3樣品，分別占比57.96%和55.58%，B1樣品菌種中占比最小僅為14.31%。子囊菌門Ascomycota是真菌中種類最多的類群，占真菌總數的40%。根據王海英［15］等研究表明，子囊菌之所以會在微生物種群中占有較大比重，可能得益于奠基者效應，與其遺傳特性有關。而在B1樣品子囊菌門Ascomycota的占比卻不及被孢霉門Mortierellomycota和擔子菌門Basidiomycota，其是否與植物、環境以及其他微生物的影響有關還有待進一步研究。擔子菌門Basidiomycota真菌是樣品真菌種群中占比較大的另一真菌門類，為優勢菌門，但其與子囊菌門Ascomycota不同，其在各個樣品中的占比差異較大，如在B1、B2和A2樣品中的占比分別為25.31%、23.63%和18.4%，但在A1、A3、B3樣品中的占比較低。其可能是采樣環境與人類的活動有關。被孢霉門Mortierellomycota在A2和B1樣品中占比較大，在其他樣品中的占比較少，是A2和B1的優勢菌群。羅茲菌門Rozellomycota在A3樣品中的占比明顯高于其他樣品，其是A3樣品的一類優勢菌屬。此外，各樣品中還存在大量未分類真菌unclassified。在屬分類水平上，樣品間幾乎沒有共有菌屬。而在種分類水平上，6個樣品真菌菌種豐度整體差異較大，在個別菌種豐度上具有一定的特有性。綜合來看，6個產地的兩面針根際土壤真菌種群在菌群物種和豐度上具一定的共性和差異性。

從李毳等［16］研究發現，黨參、柴胡和遠志3個藥用植物根際土壤真菌主要來源于子囊菌門Ascomycota和擔子菌門Basidiomycota，且物種豐度也較高，屬于優勢菌屬。從潘爭艷等［17］對遼寧省14種藥用植物根際土壤真菌的研究表明，子囊菌門Ascomycota真菌在藥用植物根際真菌中的種類和豐度均較高。而從屬水平來看，青霉屬Penicilliums、曲霉屬Aspergillus、木霉屬Trichoderma和鐮孢菌屬Fusarium均為藥用植物根際土壤真菌常見的優勢菌屬［16-18］，但不同藥用植物其物種豐度有顯著差異。對比以上藥用植物根際土壤真菌種群多樣性的研究發現，不同藥用植物根際土壤真菌在物種組成上具有較高的相似性，其主要的差別在于物種的豐度差異［16-20］，其可能也與土壤本身的微生物種群有關系［21］。

在植物根際微生態系統中，植物、土壤、微生物3個因素是相互聯系，相互影響的，并且受到植物群落和氣候條件等外界環境的影響。因此，開展三者在根際微生態系統中的生物作用關系研究，對揭示不同地域植物生長發育、中藥道地藥材形成機制具有重要的意義［22-23］。兩面針是我國南方常見中藥材，主要分布于廣東、廣西、福建等地［24］。有研究表明［25］，不同生長方式的兩面針所含氯化兩面針堿的含量有較大差異，而其與地域、品種和栽培方式的差異相關性較小。據相關文獻研究表明［26］，兩面針植物內生真菌能夠產生與宿主植物相同或相似的化學成分，而內生真菌作為真菌的一種，其在生理特性和親緣關系上與土壤真菌具有密切聯系，因此本研究從土壤從根際真菌入手，探討不同地域環境下兩面針根際真菌種群多樣性的異同，為兩面針藥材的合理化種植提供參考依據。

植物根際微生物多樣性受到植物物種、生態環境、地理因素以及人類生產活動等因素影響［27-30］，因而開展植物根際微生物多樣性研究是關鍵的，也是復雜的。高通量測序技術的出現大力推動了植物根際微生物多樣性研究的快速發展，研究人員可通過分子生物學、生物信息分析學以及統計學等交叉學科分析，了解根際微生物的種類、物種豐度、遺傳關系以及功能預測。但由于其涉及學科較多，使得數據分析難度增大，加之微生物種類龐大、分類復雜，因此給合理開展微生物多樣性評價和分析結果的運用增添了不小的難度。

4 結論

通過對6個不同產地兩面針植物根際土壤真菌菌落組成和物種豐度的對比分析研究，發現兩面針根際土壤真菌菌落組成和物種豐度非常豐富，共分屬于8個真菌門類，涉及數百個真菌物種，但不同產地的土壤真菌菌落組成和物種豐度存在顯著差異。菌落組成和物種豐度受土壤顆粒、酸堿度、有機質含量等環境因素影響。研究表明，6個產地根際土壤多偏于酸性，質地多為黏土土質。6個產地根際土壤真菌生物多樣性由高到低分別為B3＞A3＞A2＞B2＞B1＞A1。