抗旱耐鹽菌劑的制備及其對甘草種子萌發的影響

張曉佳 盧亞軍 張文晉，3 張瑜 崔高暢 郎多勇 張新慧，3

（1. 寧夏醫科大學藥學院，銀川 750004；2. 天津宏仁堂藥業有限公司，天津 300122；3. 寧夏回藥現代化工程技術研究中心 寧夏回醫藥協同創新中心 回醫藥現代化教育部重點實驗室，銀川 750004）

逆境脅迫是對植物生長發育和生存不利的各種環境因素的總和，主要分為生物脅迫和非生物脅迫。逆境在植物自然生長過程中時常會對其造成損傷，嚴重時甚至會導致植物死亡［1］。目前化學農藥、化肥雖然可以暫時緩解某些逆境脅迫，但長期使用不僅誘發病原菌產生抗藥性，而且易傷害非靶標生物，污染環境，嚴重破壞生態平衡［2］。因此，積極開發微生物菌劑具有重要的理論和實際價值。

微生物菌劑（Microbial agents），通稱為生物肥料、菌肥、接種劑，是一類以微生物生命活動及其產物使農作物得到特定肥料效應的微生物活體制品。微生物是土壤最活躍的組成，土壤微生物被稱為土壤C、N、S和P等養分元素的“轉化器”，環境污染的“凈化器”［3］。劉洪光［4］發現鹽脅迫條件下接種AM真菌作為生物肥料，具有提高枸杞生長，以及改善枸杞產品品質的潛力。何艷慧［5］研發了一款微膠囊菌劑并發現其對棉花具有解鹽、促生效果。武海濤［6］研究發現枯草芽孢桿菌菌液可以有效減緩鉛對植物的傷害，從而增強小麥對鉛脅迫的適應性。只要條件適合，肥料中的微生物就能夠保持其自身旺盛的繁殖力和進行新陳代謝等生命活動，進而進行物質轉化和產生有益的代謝物，增加植物養分的供應，促進植物生長，增強植物抗逆性，改善農業生態環境及提高農產品品質［7］。

由于短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）能產生熱穩定的內生芽孢，且耐高溫、耐酸堿及耐擠壓等抗逆能力強，并對多種病原真菌、細菌均有較強的抑制作用，抗菌譜廣泛，成為越來越受矚目的生防研究材料之一［8］。實驗室前期從甘草根中分離純化獲得一株優良菌株，經生測實驗具有耐鹽、酸堿性，對多種病原菌具有拮抗活性［9］，經鑒定為短小芽孢桿菌。且經盆栽實驗表明該菌可定植于甘草內部，從而緩解干旱脅迫，促進生長［10］。本研究對短小芽孢桿菌進行發酵條件優化實驗，獲得制備高產新型微生物菌劑的制備工藝，并研究該菌劑對旱鹽逆境脅迫下甘草幼苗的發芽、生長情況，考察其對甘草抗氧化系統、滲透調節、碳氮代謝過程的影響，旨為以后植物抵抗逆境脅迫開辟新的途徑［11］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 短小芽孢桿菌保藏號為CGMCC No.16879：課題組前期從甘草根中分離、純化、鑒定所得。

1.1.2 基礎培養基（NA培養基） 葡萄糖1.5%；牛肉膏0.5%，蛋白胨1.5%；無機鹽NaCl 0.5%；水96%，用NaOH或HCl調pH 至7-8，121℃高壓滅菌20 min。固體培養基向其中加1.6%的瓊脂。

1.1.3 種子培養基（牛肉膏蛋白胨培養基） 牛肉膏0.3%；蛋白胨1.0%；NaCl 0.5%；其余為水。調 pH至7-8，121℃高壓滅菌20 min。固體培養基向其中加1.6%的瓊脂。

1.1.4 主要試劑 葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、山梨醇、D-聚糖、D-木糖、可溶性蛋白、酵母浸粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、Na2HPO4、KCl、K2HPO4、MgSO4·7H20和KH2PO4等。

1.1.5 儀器設備 紫外分光光度計、高溫滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫搖床、恒溫培養箱、電子分析天平；培養皿、玻璃棒、試管及試管架、燒杯和錐形瓶等。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 將分離得到的短小芽孢桿菌菌株轉接到NA固體培養基，37℃恒溫培養48 h，備用。

1.2.2 種子液的制備 挑取單菌落，接入NA培養基中，置于控溫搖床，30℃，170 r/min培養24 h，備用。

1.2.3 菌體生物量測定方法 采用比濁法［12］檢測菌體量：將發酵液稀釋100倍，以未接種培養基作對照稀釋100倍后分光光度計275 nm處檢測吸光度。

1.2.4 短小芽孢桿菌培養基篩選優化 單因素篩選發酵培養基的碳源、氮源、無機鹽的種類和濃度，碳源種類設為葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、山梨醇、D-聚糖、D-木糖和可溶性蛋白，濃度為0.5%-5.0%。氮源設為酵母浸粉、蛋白胨、大豆蛋白胨及牛肉膏，濃度為0.5%-5.0%。無機鹽為Na2HPO4、KCl、K2HPO4、MgSO4·7H20、KH2PO4、NaCl和NaOH，濃度為0.01%-0.08%。在單因素試驗的基礎上選用3因素3水平L9（33）正交表（表1）進行實驗，以尋求培養基中各組分的最佳配比。

表1 發酵培養基組成因素和水平

1.2.5 短小芽孢桿菌發酵工藝的篩選優化 以實驗室前期篩選優化所得發酵配方進行接下來的發酵工藝優化實驗。探究發酵時間、發酵溫度、初始pH、搖床轉速、接種量及裝液量單因素對短小芽孢桿菌生長的影響。以基礎發酵工藝為基礎，考察某因素時，固定其他因素。發酵時間從12 h開始考察，每隔6 h取樣測定OD275；發酵溫度設置為26-42℃；初始pH3-10；搖床轉速110 r/min-230 r/min；接種量0.5%-5.0%；裝液量50/250-230/250 mL。以單因素試驗結果作為中心點，發酵液OD275為響應值，進行RSM設計［13］。每個試驗重復3次，取其平均值，試驗因素水平及相應的編碼見表2。RSM方法采用“Design-Expert 8.0.6”esignBBD模型，得到6因素3水平共54組的試驗設計（表3）。將實驗后的數據進行多元回歸擬合，并對回歸方程進行方差分析及擬合度檢驗，討論模型所在響應面特征，預測最大響應值并驗證模型。

表2 響應面分析因素與水平

1.2.6 短小芽孢桿菌菌劑制備 經優化后發酵培養基、發酵工藝生產所得發酵液即為短小芽孢桿菌液體菌劑。液體菌劑呈深褐色，有效活菌數為425 CFU/mL，pH7-8，存放于4℃冰箱備用。施用方式為稀釋50倍，浸種。

1.2.7 甘草水培發芽試驗 甘草種子收獲于2019年，經寧夏醫科大學藥學院張新慧教授鑒定為甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）種子。凈種后，將其裝入牛皮紙袋置于冰箱冷藏室貯藏。

1.2.7.1 種子預處理 本試驗精選籽粒飽滿、大小均一的甘草種子，先用85%濃H2SO4浸潤45 min，不定時攪拌，然后用蒸餾水沖洗3遍，再用0.1%的H2O2消毒10 min，最后用蒸餾水沖洗數次至無黏性，洗凈后置于燒杯中，用蒸餾水浸泡6-8 h使種子充分吸水，待用。

1.2.7.2 實驗設計 采用完全隨機設計，鹽基采用中性鹽NaCl，濃度為100 mmol/L；聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）6000模擬干旱脅迫，濃度為10%；處理分別為對照（CK）、鹽脅迫（S）、干旱脅迫（D）、對照加菌（CK+B）、鹽脅迫加菌（S+B）、干旱脅迫加菌（D+B）。選取充分吸水、飽滿均一的甘草種子，吸干表面水分，將其均勻擺放在墊有雙層無菌濾紙并加入5 mL不同濃度處理溶液的培養皿（9 cm × 9 cm × 3 cm）中進行萌發，每皿40粒。實驗條件為光照/黑暗（12 / 12 h，28 / 20℃）。每天用稱重法加蒸餾水至恒質量以保持恒定的處理液濃度。實驗第2天測定發芽數，第6天基本發芽結束，第9天采樣，采樣過程中測定生長及生理生化指標。

1.2.7.3 生長及生理生化特性測定

（1）種子萌發指標測定

發 芽 率（%）=（發 芽 種 子 數/供 試 種 子數）×100%；

發芽勢（%）=（規定日期內發芽種子數/供試種子數）×100%；

發芽指數=Σ第幾日的發芽數/發芽試驗第幾日）。

幼苗活力指數=幼苗生長量（長度或重量）×發芽指數。

（2）生長指標測定 用直尺測定甘草胚芽、胚根長度，游標卡尺測定胚芽、胚根的粗度等生長指標。

（3）抗逆生理生化指標測定 谷胱甘肽（Glutathione，r-glutamyl cysteingl +glycine，GSH）、抗環血酸AsA含量測定采取分光光度法［14］：可溶性蛋白測定采取考馬斯亮藍法，可溶性糖測定采取蒽酮比色法［15］；硝酸還原酶（Nitrate reductase，NR）、蔗糖轉化酶（Invertase，INV）測定采取比色法［16］。

表3 響應面設計

1.2.8 統計分析 采用SPSS 17.0軟件進行方差分析和顯著性檢驗，多重比較用Duncan法（P＜ 0.05），Excel 2003作圖，圖中的數據均為3次重復的均值± 標準誤。響應面分析采用Design Expert 8.0.6 軟件。

2 結果

2.1 發酵培養基單因素試驗結果

由圖1可知，適合短小芽孢桿菌生長的最佳碳源是麥芽糖，最佳重量百分比為4.5%；適合短小芽孢桿菌生長的最佳氮源是大豆蛋白胨，最佳重量百分比為3.5%；適合短小芽孢桿菌生長的最佳無機鹽是KH2PO4，最佳重量百分比為0.02%。

2.2 發酵培養基正交試驗結果

由表4可知，極差分析結果為：RC＞RA＞RB，各因素影響菌體生長程度從大到小為KH2PO4＞麥芽糖＞大豆蛋白胨。最佳組合為 A1B1C1，即麥芽4.0%，大豆蛋白胨3.0%，KH2PO40.01%。

由表5方差分析可得：麥芽糖、KH2PO4對OD275值均有顯著影響，而大豆蛋白胨沒有顯著影響。但其影響的程度有較大差異，這3個因素對菌體生物量OD275值作用的大小依次為：A＞C＞B，即各因素影響菌體生長程度從大到小為麥芽糖、KH2PO4、大豆蛋白胨。綜上可得：極差分析與方差分析結果均顯示最佳組合為 A1B1C1，即麥芽糖4.0%、大豆蛋白胨3.0%、KH2PO40.01%。

2.3 優化后的最佳組合培養基與基礎培養基比較

短小芽孢桿菌分別在優化后的培養基與優化前的培養基中，即基礎培養基采用常規的發酵工藝在250 mL 的恒溫搖床中發酵，用紫外分光光度法測定OD275值；優化后的培養基較優化前OD275值顯著增159.4%

2.4 發酵工藝單因素試驗結果

由圖2可知，不同的發酵時間、發酵溫度、初始pH、搖床轉速、接種量和裝液量對菌體的生物量有顯著影響（P＜0.05）。單因素試驗可得：發酵時間36 h，發酵溫度30℃，搖床轉速200 r/min，接種量2.0%，裝液量為110 mL/250 mL，并選擇其作為下一步響應面試驗的中心試驗點。

2.5 發酵工藝響應面優化結果

2.5.1 響應面模型的建立 響應面試驗設計及結果見表3。利用Design Expert 8.0軟件對表5數據進行多元回歸擬合，獲得的響應值菌體生物量（Y）對 編 碼 自 變 量 X1、X2、X3、X4、X5和X6的 二 次多項式回歸模型方程為Y=24.81-0.03X1-0.39X2-3.05X3-0.08X4+0.49X5+0.02X6+5.97X1X2+4.96X1X3+7.65X1X4+8.79X1X5-2.24X1X6+0.03X2X3+1.35X2X4-2.28X2X5-2.94X2X6-1.52X3X4-0.03X3X5+2.64X3X6-2.7 6 X4X5+2.4 6 X4X6+1.4 8 X5X6-4.1 2 X12-1.24X22+0.12X32+1.33X42-0.02X52-1.48X62。

2.5.2 回歸模型方差分析 對上述回歸模型進行方差分析，結果見表6。可以看出，回歸模型的P=0.000 2，失擬項的P= 0.233 2，模型回歸極顯著，失擬檢驗不顯著，說明未知因素對實驗結果干擾很小，不需要引入更高次數的項，模型適當。

2.5.3 響應面圖及其等高線 由回歸方程所作的響應面立體分析圖及其等高線如圖3-4所示，其中X1X2、X1X3、X1X4、X1X5、X2X5、X2X6及X5X6這7組響應面均為開口向下的凸形曲面，且通過方程可知，X1、X2、X3及X4二次項的系數均為負值，其所表征的拋物面開口向下，說明響應值存在極高值。軟件所得數據結合實際確定最佳培養條件為：發酵時間為42 h、發酵溫度為34℃初始pH為7.00、搖床轉速為230 r/min、接種量為2.0%、裝液量為

100 mL/250 mL。

2.6 回歸模型的驗證

實際值與預測值擬合率達82%，有良好的擬合性，優化模型可靠。同時，優化后的菌體生物量比優化前提高了4.3倍，明顯提高了短小芽孢桿菌的生物量。

2.7 短小芽孢桿菌菌劑對旱鹽脅迫下甘草發芽及生長情況的影響

圖1 碳源、氮源、無機鹽的種類及重量百分比對菌體生物量的影響

由圖5-6可知，接種微生物菌劑后，甘草幼苗發芽率、發芽勢、發芽指數、幼苗活力指數均有不同程度增長。發芽勢最高，在干旱脅迫下接種菌劑較干旱脅迫下未接種菌劑甘草的發芽勢顯著增長14%；發芽指數最高，在干旱脅迫下接種菌劑較干旱脅迫下未接種菌劑甘草的發芽指數顯著增長15%；幼苗活力指數最高在干旱脅迫下接種菌劑較干旱脅迫下未接種菌劑顯著可增長18%。接種微生物菌劑后，甘草胚根長度、胚根粗度、胚芽長度、胚芽粗度均有不同程度的增長，最高在干旱脅迫下接種菌劑較干旱脅迫下未接種菌劑甘草胚芽長度增長33%。

表4 正交試驗設計和結果

表5 方差分析

2.8 短小芽孢桿菌菌劑對旱鹽脅迫下甘草抗氧化指標的影響

由圖7可知，甘草抗氧化系統指標中GSH、AsA接種微生物菌劑后，對鹽脅迫下的甘草幼苗的影響尤為顯著。鹽脅迫下接種菌劑甘草幼苗中GSH含量較未接種菌劑顯著提高44%，AsA含量較未接種菌劑顯著提高64%。

2.9 短小芽孢桿菌菌劑對甘草滲透調節物質的影響

如圖8所示，在接種微生物菌劑后，對甘草滲透調節物質可溶性糖、可溶性蛋白具有顯著影響，對鹽脅迫下的甘草幼苗的影響尤為顯著。鹽脅迫下接種菌劑甘草幼苗中可溶性糖含量較未接種菌劑顯著提高140%，可溶性蛋白含量較未接種菌劑顯著提高45%。

2.10 短小芽孢桿菌菌劑對甘草碳氮代謝酶活性的影響

如圖9所示，在接種微生物菌劑后，甘草幼苗碳氮代謝酶NR、INV活性增加，對鹽脅迫、干旱脅迫下的甘草幼苗均有顯著影響，干旱脅迫下接種菌劑甘草幼苗中NR酶活性較干旱脅迫下不接種菌劑顯著增加77%，鹽脅迫下接種菌劑INV酶活性較鹽脅迫下未接種菌劑顯著增加445.5%。

3 討論

3.1 菌劑制備過程中的的影響因素

微生物菌劑的研究開發應用受到生物肥料及農藥等研究開發者的普遍重視，產品種類繁多。液體菌劑由于生產周期短、水溶性好、施肥方式簡便而廣受歡迎，但在研究、生產和應用中也存在不少的問題，其中之一就是發酵液的活菌數量不高，限制了產品的推廣使用。本研究將菌劑制備過程中的影響因素主要分為發酵培養基和發酵工藝兩大模塊進行探討。王美英等［17］研究發現多粘類芽孢桿菌對麥芽浸粉的利用率最高，可以作為生產芽孢的有效碳源。林戎斌等［18］以細胞生物量為指標篩選優化地衣芽孢桿菌的培養基時發現大豆蛋白胨為其最適氮源。有研究表明，鉀離子可提高細菌發酵產物產量，提高其催化及代謝功能，增強抑菌活性［19-20］。吳婷婷［8］以芽孢數量篩選優化短小芽孢桿菌Y11的培養基時發現KH2PO4對其具有顯著影響。以上研究與本研究結果一致，采用優化后發酵培養基菌體生物量提高了將1.59倍。本研究發現，短小芽孢桿菌在12 h-18 h快速生長，36 h時短小芽孢桿菌的生物量達到最大值。當菌體的發酵溫度升高達到30℃時，菌體生物量達到峰值。這與尹萌萌等［21］研究發現短小芽孢桿菌產蛋白酶、菌體生長的最適培養溫度為28℃基本一致。本研究發現當發酵pH6.0菌體生物量達到第一個峰值，當發酵pH值為8.0時達到第二個峰值，此時為菌體生物量的最大值，這可能與菌體自身的某些生物學特性有關，呈現明顯的嗜弱酸、弱堿性［22］。在本研究中，短小芽孢桿菌在其他水平接種量時菌體生物量并無明顯升高及降低，但在接種量為2.0%時菌體的生物量明顯升高，有大量研究發現，接種量2.0%時菌體生長最好，與本研究結果一致［23］。液體發酵過程中氧濃度對菌體生長影響顯著，最直接的體現在搖瓶的裝液量，本研究發現，裝液量在110 mL/250 mL-140 mL/250 mL時，短小芽孢桿菌生物量較高，這可能與芽孢桿菌為嚴格需氧與兼性厭氧菌種的生物特性有關［24］。

圖2 發酵時間、發酵溫度、初始pH等6個單因素對菌體生物量的影響

表6 回歸模型方差分析

圖3 發酵時間與發酵溫度、初始pH、接種量、搖床轉速的交互作用所得3D響應面

3.2 菌劑對旱鹽脅迫下甘草生長及發芽情況的影響

圖4 發酵溫度與接種量、裝液量的交互作用及接種量與裝液量的交互作用所得3D響應面

圖5 不同處理甘草幼苗發芽情況的變化

內生菌作為一種促進植物生長發育、增強宿主抗逆性的天然資源，對鹽脅迫下植物的生長具有顯著促進作用。如龐發虎等［25］研究發現內生細菌可以促進小麥的生長；傅蕾［26］研究發現象草內生菌能夠有效緩解中、低鹽濃度脅迫對雜交狼尾草種子萌發的毒害作用，對種子的發芽率、發芽指數、胚芽長度都有顯著的增益和改善作用。在本研究中，旱鹽脅迫下接種短小芽孢桿菌菌劑后，甘草生長指標有不同程度的增長；甘草幼苗發芽率、發芽勢、發芽指數、幼苗活力指數均有不同程度增長。

圖6 不同處理甘草幼苗生長指標的變化

圖7 不同處理甘草幼苗中甘草抗氧化指標的變化

圖8 不同處理甘草幼苗中滲透調節物質的變化

圖9 不同處理甘草幼苗中碳氮代謝酶活性的變化

3.3 菌劑對旱鹽脅迫下甘草抗氧化系統的影響

植物受到環境脅迫時，首先通過自身系統的特異保護機制來減輕環境對自身的傷害作用，即促進抗氧化酶類的活性及非酶抗氧化劑（GSH、ASA）的含量。本研究結果表明，接種短小芽孢桿菌菌劑可顯著提高鹽脅迫下甘草中GSH、AsA含量。已有大量研究表明，接種內生菌可以提高大豆、小麥、番茄、玉米等作物的抗氧化酶活性，增強作物清除活性氧的能力，使作物抗鹽性增強，促進植物的生長發育［27］。張詩婉［28］研究發現接種植物內生菌可以增強GSH-AsA循環中相關物質的活性，緩解逆境脅迫對水稻的傷害。

3.4 菌劑對旱鹽脅迫下甘草滲透調節物質的影響

滲透調節是植物抵御逆境的一種重要方式，也是植物在逆境脅迫下誘導保護性應答的一種重要生理機制。可溶性蛋白、可溶性糖是植物重要的滲透調節物質，它的升高會提高幼苗對脅迫的耐受能力。研究表明，植物的滲透調節能力與抗逆效果存在相關性，抗逆效果強的植物其滲透調節能力也相對較強。周紅艷等［29］研究表明，噴施EM菌劑可促進重金屬鉛脅迫下溝葉結縷草生長，顯著提高可溶性糖含量、可溶性蛋白等滲透調節物質的積累，增強抗性。而本研究中，接種短小芽孢桿菌菌劑后，旱鹽脅迫下甘草幼苗中可溶性糖顯著增加；可溶性蛋白在鹽脅迫下顯著增加，在干旱脅迫下反而呈下降趨勢。

3.5 菌劑對旱鹽脅迫下甘草碳氮代謝過程中酶活性的影響

碳氮代謝是植物體內基本代謝途徑，直接或間接影響著植物產量及其品質的形成。研究表明硝酸還原酶活性強弱與植物氮代謝強弱呈正相關，其活性強，氮代謝旺盛，植物生長旺盛；蔗糖轉化酶與植物的生長有密切關系，是衡量同化產物的轉化和利用、植物細胞代謝及生長強度的指標［30］。本研究發現短小芽孢桿菌菌劑可顯著提高干旱脅迫下甘草硝酸還原酶、蔗糖轉化酶活性，顯著提高鹽脅迫下蔗糖轉化酶的活性，對硝酸還原酶的影響不大。

綜上所述，制備所得短小芽孢桿菌菌劑通過提高抗氧化物質含量、滲透調節物質含量以及調節碳氮代謝過程的酶活性，提高甘草的抗旱耐鹽性，進而促進生長。研究結果為干旱地區、鹽堿地區土壤改良和生態修復提供了基礎數據和技術支持。

4 結論

單因素結合正交試驗得到最佳發酵培養基為：麥芽糖4.0%，大豆蛋白胨3.0%，KH2PO40.01%，其余為水。單因素結合響應面優化得到最佳發酵工藝為：發酵時間42 h、發酵溫度34℃、初始pH 7.00、搖床轉速230 r/min、接種量2.0%、裝液量100 mL/250 mL。最佳發酵培養基、發酵工藝下生產短小芽孢桿菌獲得的液體菌劑：有效活菌數425×108CFU/mL，pH為7-8，顏色為深褐色，有特殊氣味。

菌劑施用于甘草，可提高抗氧化物質、滲透調節物質含量及調節碳氮代謝酶活性，提高甘草的抗旱耐鹽性，進而促進其生長。