一株青枯菌專性噬菌體的分離及應用效果研究

王孝芳 侯玉剛，2 楊可銘 王佳寧 韋中 徐陽春 沈其榮

（1. 南京農業大學資源與環境科學學院 作物免疫重點實驗室 江蘇省固體有機廢棄物資源化高新技術研究重點實驗室 江蘇省有機固體廢棄物資源化協同創新中心 資源節約型肥料教育部工程研究中心 國家有機類肥料工程技術研究中心，南京 210095；2. 中化作物保護品有限公司，上海 200125）

集約化農業的不合理發展導致土傳病害頻發，造成嚴重的糧食減產和經濟損失。以茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的土傳細菌性病害——青枯病為例，該病害在我國大部分地區都有分布，能夠侵害馬鈴薯、番茄、煙草、花生等20多種重要的經濟作物，嚴重時造成絕收［1-2］。傳統的化學防治，如農藥或對土壤熏蒸，短期內見效快，但存在誘導耐藥菌產生的風險，且嚴重破壞了土壤的土著微生物區系；抗性品種、嫁接輪作等措施研發周期長、田間應用效果不穩定。所以土傳病害的防控亟需高效穩定、精準靶向病原菌的生防措施。土壤中存在一類特殊的微生物——噬菌體，能夠特異性侵染細菌的一類病毒。噬菌體在環境中普遍存在，其數量是細菌的10倍以上，土壤中噬菌體的豐度高達109/g土，且多樣性高［3］。土壤中豐富的噬菌體資源在土傳青枯病的生物防控中發揮著重要的作用。不同類型的青枯菌專性噬菌體，如巨型肌尾噬菌體ΦRSL1［4］、肌尾噬菌體ΦRSA1［5］、短尾噬菌體ΦRSB1［6］和絲狀噬菌體ΦRSM1［7］均能從環境中分離獲得，部分噬菌體也完成了基因組測序分析，不斷豐富了噬菌體庫。這些青枯菌專性噬菌體對土傳青枯病具有一定的防控效果。Fujiwara等［8］利用3株噬菌體ΦRSL1、ΦRSA1和ΦRSB1抑制青枯菌，結果發現ΦRSA1和ΦRSB1單獨或與其它噬菌體組合處理，都能快速降低病原菌的數量。利用噬菌體抑制土傳病原菌具有很多優勢：（1）宿主專一性，噬菌體能夠特異性靶定病原菌，對環境擾動小；（2）噬菌體能夠快速增殖，高效裂解病原菌；（3）相比病原菌對抗生素耐藥性的單向進化，噬菌體與宿主菌協同進化，動態阻控病原菌等［9-11］。噬菌體的抑菌優勢使得其成為土傳病害防控重要的“后備軍”。

土傳青枯病難以防控的一個重要原因是環境中病原青枯菌的遺傳型和生理型呈現高度的多樣性。前期研究發現即使來自同一株植物的青枯菌的生理型也存在較大變異，而噬菌體對不同來源的青枯菌的侵染能力不同，呈現空間上的原位適應性，即噬菌體對來自同一個地區的細菌侵染能力更強。為了更好地靶定特定環境下的病原青枯菌，可以從病原菌豐富的原位土壤中篩選侵染能力強的噬菌體，其效果一般優于其他地區分離獲得的噬菌體。在獲得抑菌能力強的噬菌體后，為了最大限度發揮噬菌體的防控效率，還需要要考慮其環境穩定性、最佳的保存條件和應用方法。若保藏方法不當會造成噬菌體污染，且抑菌能力下降。為了保證噬菌體穩定的抑菌效果，且兼顧噬菌體產品的生產、運輸成本，需要探究噬菌體最佳的保存方式，以維持噬菌體的效價和活性。噬菌體在應用過程中，傳統的灌根接種方式下，噬菌體與病原菌的定向互作會受到土壤結構、水分、溫度及根際微生物等生物和非生物因素的影響，為了減少土壤因素對噬菌體的影響，需要探究噬菌體最佳的應用方式。與灌根法相比，莖部注射的接種方式被認為是一種經濟有效的措施［12］，但是否適用于噬菌體的接種還有待進一步研究。

目前利用噬菌體防控土傳青枯菌仍缺乏從篩選→鑒定→穩定性和保存→應用效果的提升這一套完整的研究體系，本研究擬以青枯病發病典型地區的番茄根際土壤中分離的強致病性青枯菌為宿主，從原位土壤中分離篩選專性青枯菌的噬菌體，并以其中一株抑菌能力最強的噬菌體為研究材料，研究了該噬菌體的基礎生物學特性，并檢測了其在不同脅迫下的穩定性，以及噬菌體的最佳保存方式，最后比較了灌根和莖部注射接種方式對該噬菌體防控番茄土傳青枯病效果的影響，以確定經濟有效的噬菌體施用方式。本研究系統地闡明了噬菌體防控土傳青枯病的研究過程，旨為大規模利用噬菌體療法防控土傳病害奠定理論基礎和提供研究模式。

1 材料與方法

1.1 材料

供試土樣：從南京麒麟后村蔬菜大棚（118°57' E，32°03' N）番茄青枯病發病田塊中采集植株根際土壤樣品。

供試菌株：宿主青枯菌為從南京市麒麟鎮發病番茄植株中分離獲得的具有強致病力的青枯菌QLRs1115（簡稱RS）［13］。

供試番茄品種：Mcrio-Tom矮化品種，美國泛美種子公司生產。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體的分離與純化 稱取10 g根際土樣于已滅菌三角瓶中，加入90 mL無菌水混勻，于搖床中30℃，170 r/min振蕩培養1 h，離心（12 000×g，5 min），過濾（0.22 μm的水系濾膜）獲得無菌的懸液；取5 mL懸液接種至青枯菌RS菌液（OD600為0.5，～108CFU/mL）中，30℃，170 r/min振蕩富集培養12 h。將富集后的懸液于12 000 ×g高速離心5 min，取上清液過濾，得到噬菌體原液。取10 mL RS菌液與150 mL冷卻至室溫的NA半固體培養基（NA培養基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉浸膏3 g/L，酵母粉0.5 g/L）混勻，立即倒入已凝固的NA固體培養基平板上制成雙層平板，待上層培養基凝固后將平板分區，分別點接20 μL梯度稀釋的噬菌體懸液（101-108）于平板分區中，30℃靜置培養24 h。挑取最高稀釋倍數下單個最大的噬菌斑接入到RS菌液中，振蕩培養12 h，懸液離心過濾獲得較純的噬菌體。上述方法重復3-4次，獲得純化后的噬菌體。

1.2.2 噬菌體的基礎特性檢測 噬菌斑大小：不同噬菌體梯度稀釋后點接在含宿主青枯菌的雙層瓊脂平板上，30℃靜置培養24 h，檢測單個噬菌體形成的噬菌體斑的直徑大小。

噬菌體的抑菌效果：利用微孔板培養系統，196 μL NA培養基中接種2 μL RS菌液（～108CFU/mL）和2 μL 噬菌體懸液（～107PFU/mL），以2 μL無菌水作為對照，30℃，170 r/min振蕩培養，測定不同時間點病原菌的生長情況（OD600值）。噬菌體的抑菌時間為青枯菌的OD600開始增長的時間點；噬菌體的抑菌率=（OD600對照-OD600處理）/OD600對照。

噬菌體的形態觀察：取20 μL濃縮后的噬菌體粗制顆粒滴在銅網上，靜置沉淀15 min，滴一滴2%的PTA（磷鎢酸）進行染色，靜置10 min后用濾紙吸走側面多余的染色液，繼續靜置5 min使樣品干燥，利用透射電子顯微鏡觀察噬菌體的形態。

1.2.3 噬菌體基因組測序 按照試劑盒提供的方法提取噬菌體基因組DNA，檢測DNA濃度和純度。由上海凌恩生物科技有限公司利用Illumina Hiseq技術對樣品DNA進行paired-end測序。用SOAPdenovo（版本：2.04）和GapCloser（版本：1.12）組裝得到噬菌體全基因組。用GeneMarkS（版本4.25）預測基因，與NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、VFDB數據庫比對注釋。

1.2.4 噬菌體穩定性及保存效果檢測 噬菌體穩定性測定：熱穩定性，噬菌體懸液（～108PFU/mL）分別 放 在4、20、30、40、50、60、70和80℃水 浴鍋中水浴2 h；pH耐受力測定：噬菌體懸液（～108PFU/mL）分別加入到 pH為3、4、5、6、7、8、9、10的已滅菌NA培養基中，28℃水浴2 h；紫外線耐受力測定：噬菌體懸液（～108PFU/mL）3 mL均勻平鋪于無菌培養皿中，放入超凈工作臺距離紫外燈30 cm處 照 射0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 min。比較不同處理后噬菌體對青枯菌的抑菌效果，具體方法同方法1.2.2，以噬菌體的抑菌效果評估其穩定性。

噬菌體儲存條件：噬菌體懸液（～1011PFU/mL）分別與無菌水、30%甘油、生理鹽水（0.85%NaCl）、SM緩沖液（MgSO4·7H2O 2.0 g/L，NaCl 5.8 g/L，1 mol/L Tris-HCl（pH7.5）50 mL/L，2%明膠5 mL/L）按照1∶1比例混勻于無菌離心管中，置于4、25和37℃溫度下培養7 d，分別在1 d、2 d、4 d、7 d檢測噬菌體效價和侵染活性的變化。其中噬菌體效價測定利用雙層瓊脂平板法，侵染活性的測定利用微孔板法。

1.2.5 噬菌體防控番茄土傳青枯病的效果檢測 盆栽試驗：設置灌根、莖部注射2種方式接種噬菌體，以不接種噬菌體為對照處理，共3個處理，每個處理3個重復，每個重復9株番茄苗。番茄種子經表面消毒后催芽2 d，育苗，3片真葉時移栽至9孔盆缽中。移栽7 d后接種青枯菌，濃度為～107CFU/g干土。接種青枯菌7 d后接種噬菌體懸液，莖部注射處理：植株第一片真葉葉柄下方，先用含有75%酒精的棉簽消毒，然后用移液槍注射10 μL噬菌體（～109PFU/mL）；灌根處理：5 mL噬菌體澆灌到根部土壤中（～106PFU/g干土）。所有盆缽置于溫室條件下（江蘇宜興國家有機類肥料工程技術研究中心，白天25-32℃，夜間20-25℃，自然光照時間）培養，每隔2 d隨機調整盆缽的位置，減少環境誤差。盆栽試驗結束時統計各處理的青枯病的發病率。發病指數=［∑（各級病株數×相應發病等級）/（調查總株數×最高發病等級）］×100%，其中發病等級是根據發病時葉片萎蔫程度分為 5個等級，0級：無法發病癥狀，1級：植株有1%-25%的葉片出現萎蔫癥狀并且可以恢復；2級：植株有26%-50%的葉片出現萎蔫癥狀并且只有部分可以恢復；3級：植株有 51%-75%的葉片出現萎蔫癥狀；4級：植株有75%以上的葉片出現萎蔫癥狀甚至死亡［14］。采集根際土壤用于檢測根際病原菌的數量。

根際病原菌數量測定：稱取根際土3 g，加27 mL無菌水放置在30℃，170 r/min搖床中震蕩2 h，吸取濁液梯度稀釋后在青枯菌選擇性培養基SMSA上進行涂布［15］，培養48 h后，統計各平板菌落數量，通過稀釋倍數計算得到病原菌數量。

1.2.6 數據分析 數據處理使用SigmaPlot v 12.5、R語言（R v 3.5.1）（Team，2015）和SPSS v 20等統計分析軟件。方差分析方法為鄧肯多重檢驗（Duncan’s Multiple Range Test，DMRT，P＜0.05）。

2 結果

2.1 青枯菌專性噬菌體的分離與鑒定

從南京麒麟青枯病發病的大棚中采集番茄植株根際土壤樣品，利用雙層瓊脂平板法分離了5株青枯菌專性噬菌體，噬菌體的基本抑菌特性如表1所示。其中3號噬菌體的噬菌斑直徑、抑菌率和抑菌時間均最好，所以以這株噬菌體為后續試驗的材料，命名為NJ-P3。噬菌體NJ-P3在青枯菌平板上形成圓形噬菌斑，且噬菌斑清晰透明（圖1-A）。由圖1-B看出，噬菌體NJ-P3頭部均呈正十二面體結構，具有短尾，尾部長度在16-20 nm之間。經過與國際病毒分類委員會的分類標準比對，該噬菌體屬于有尾噬菌體目Caudovirales，短尾噬菌體科Podoviridae。

表1 噬菌體的篩選

圖1 番茄根際土壤中分離篩選的青枯菌專性噬菌體NJ-P3的噬菌斑（A）及電鏡形態（B）

2.2 青枯菌專性噬菌體的基因組分析

基于頭尾連接蛋白分析噬菌體NJ-P3與數據庫中其他噬菌體的系統發育距離，結果發現NJ-P3與來自韓國Seogwipo的番茄青枯病發病土壤的短尾青枯菌噬菌體DU_RP_II親緣關系最近，相似性達到72.63%，屬于短尾噬菌體（圖2-A）。

如圖2-B所示的基因組信息表明噬菌體NJ-P3基因大小為42 528 bp。經預測噬菌體NJ-P3含有51個基因，總長度為38 454 bp，覆蓋了基因組的90.42%，平均基因長度為754 bp，基因的GC百分含量為62.86%。噬菌體NJ-P3在CAZY數據庫中注釋到了裂解酶和乙酰胞壁質酶；在TCDB數據庫中注釋到了RagB/SusD結構域蛋白；在SwissProt數據庫中注釋到了裂解酶、整合酶和DNA聚合酶；在KEGG數據庫中注釋到了脫氧核糖核酸內切酶RuvC；在AntiCRISPR數據庫中注釋到了II-C型AntiCRISPR蛋白；在VFDB數據庫中注釋到了效應蛋白pipB2；在NR數據庫中注釋到了末端酶大亞基、頭尾連接蛋白、主要衣殼蛋白、RecT重組酶、穴蛋白、小尾部蛋白、整合酶、DNA結合蛋白、PD-（D/E）XK核酸酶、cI樣轉運調節蛋白。

圖2 噬菌體NJ-P3頭尾連接蛋白發育樹（A）及基因圖譜（B）

2.3 青枯菌專性噬菌體的穩定性及儲存條件

根據不同條件處理后噬菌體對病原青枯菌的抑制能力表征噬菌體的穩定性。0-50℃范圍內噬菌體NJ-P3對青枯菌均具有穩定的裂解活性，抑制率維持在76%左右。隨著溫度升高，噬菌體對青枯菌的抑制率急劇下降，說明噬菌體NJ-P3不能耐受60℃及以上的溫度（圖3-A）。pH在4-10的范圍噬菌體NJ-P3對青枯菌均具有一定的抑制效果，抑菌率在60%以上，說明噬菌體NJ-P3能夠耐受此pH范圍。pH為7時，噬菌體的抑菌效果最好，達到78%（圖3-B）。紫外線照射0 min-60 min的噬菌體NJ-P3能夠穩定抑制青枯菌的生長，抑菌率在83%左右，但隨紫外照射時間的延長，噬菌體NJ-P3的抑菌效果逐漸減弱。在90 min時噬菌體NJ-P3失去抑菌能力（圖3-C）。

比較不同溫度和溶劑對噬菌體NJ-P3貨架期（滴度）的影響。這里以不同處理下噬菌體7 d內滴度變化曲線的線下面積來表征不同處理對噬菌體滴度的影響：面積越大，說明噬菌體滴度變化較小，保存效果好；反之說明該處理噬菌體滴度下降快，保存效果不穩定。如圖3-D所示：不同溫度對噬菌體保存效果的影響有顯著差異（F2，35=14.564，P＜0.001），且隨溫度的升高（4℃→25℃→37℃）噬菌體的保存效果呈下降趨勢。不同保存溶劑同樣影響了噬菌體的保存效果，其中在3個溫度下SM緩沖液均表現出最好的的效果，而生理鹽水保存效果最差。30%的甘油在25℃時保存效果最好，在4℃和37℃時與對照（無菌水）相比差異不顯著。

圖3 噬菌體NJ-P3的穩定性（熱穩定性A、酸堿耐受性B、紫外線耐受性C）及不同溫度和溶劑對噬菌體保存效果的影響（D）

2.4 青枯菌專性噬菌體的生防效果

盆栽試驗結果表明，與對照處理（不接種噬菌體）的高發病率（87.5%）相比，接種噬菌體NJ-P3能夠有效防控番茄青枯病的發生，平均降低了69.0%的發病率。不同的接種方式（灌根和莖部注射噬菌體NJ-P3）對青枯病生防效率差異顯著（T檢驗：t4=-3.858，P=0.018，圖4）。相比灌根法，莖部注射接種噬菌體平均提高了37.5%的生防效率。綜合這些結果，表明莖部注射噬菌體是最優施用噬菌體的方式。

3 討論

本研究從土傳青枯病發病嚴重的南京麒麟蔬菜大棚中原位分離青枯菌專性噬菌體，并系統研究了其中一株抑菌能力強的噬菌體NJ-P3的穩定性、保存及應用效果。噬菌體NJ-P3在青枯菌平板上形成直徑為1-2 mm的清晰透明噬菌斑，透射電鏡觀察結果表明該噬菌體頭部呈正二十面體，屬于有尾噬菌體目，短尾噬菌體科。基因組信息也表明NJ-P3與短尾噬菌體DU_RP_II親緣性較高。噬菌體全基因組信息能夠揭示噬菌體進化的起源、方向、頻率，預測其與宿主相互作用的位點等信息［16］。通過分析噬菌體和病原菌基因組中的CRISPR、限制性修飾、原噬菌體等相互作用區域，可以構建噬菌體-細菌侵染網絡，預測噬菌體的侵染范圍［17-18］。噬菌體NJ-P3對病原青枯菌具有較強的侵染能力，可能與其位于orf45上的一個蛋白有關，通過比對基因注釋此蛋白屬于Pentapeptide_4蛋白超家族，由371個氨基酸組成。我們猜想是否因為此蛋白為毒力蛋白，進一步對其進行VFDB和GO注釋，VFDB數據庫注釋結果為沙門氏菌SL254的效應蛋白pipB2，而基因圖譜顯示該區域GC%顯著高于均值，因此猜測該蛋白可能是基因水平轉移的結果；而GO注釋發現比對的得分不高，但是結果表明其分子作用為結合，可能存在于宿主細胞上，其生物學特性應該與致病性有關，如需確定此蛋白是否具有較強毒力，還有待進一步研究。

圖4 盆栽試驗中不同接種方式對噬菌體防控番茄土傳青枯菌效果的影響

噬菌體的存活受到很多環境因素的影響，包括溫度、pH和紫外線等［19］。評估噬菌體對環境因子的適應能力是后期田間應用的基礎。本研究發現噬菌體NJ-P3的熱穩定范圍較寬，能夠耐受20-50℃，能滿足常規環境的施用溫度。pH值的大小能夠影響噬菌體的吸附程度，由于環境pH改變會引起噬菌體基團電荷的改變，進而對噬菌體的吸附蛋白和細胞受體的空間構象產生影響，而使二者之間難于相互匹配。噬菌體NJ-P3在pH為4-10范圍抑菌效果穩定，在中性環境（pH為7）裂解活性最高。有研究表明，紫外線主要是通過對微生物的輻射損傷和破壞核酸的功能使微生物失活，噬菌體NJ-P3在經過紫外線照射80 min后仍有較高的裂解能力，當照射時間超過90 min時，其殺菌能力完全喪失，噬菌體自身對紫外線有一定的耐受能力，但超過一定時間噬菌體會失活，喪失抑菌能力。與現有的青枯菌噬菌體資源相比［8］，噬菌體NJ-P3的穩定性較強。

為了保證噬菌體穩定的抑菌效果，且兼顧噬菌體產品的生產、運輸成本，本研究評估不同方式對噬菌體NJ-P3的保存效果（貨架期）的影響。傳統的凍液法和干燥法對噬菌體的長期保存效果好，但對設備要求高，如超低溫冰箱和干燥儀等，且生產成本高［20］。本研究擬提供經濟適用、效果穩定、適合大規模生產的懸液保存法。研究發現噬菌體NJ-P3在SM緩沖液中的保存效果最好，短期內噬菌體的滴度變化不大。前人的研究也表明SM緩沖液可以有效保護噬菌體［21-22］，可能是由于SM緩沖液中的鎂離子可以保護噬菌體蛋白外殼［23］；明膠可以阻止低分子物質的碳化和氧化，且減弱溫度變化對噬菌體的活性物質的影響；Tris可以緩沖環境pH的劇烈變化。利用SM緩沖液作為噬菌體的保護劑，方法簡單、成本低，具有較好的應用前景。

噬菌體施用到土壤中時會受到很多因素的影響，如土壤的養分可利用性、pH、溫度、水分含量和土壤黏粒等均會影響噬菌體與宿主細菌之間的相互作用［19］，進而影響噬菌體對病原菌的抑制效果。為了減少土壤環境對噬菌體的影響，本研究提出利用莖部注射接種噬菌體，直接將青枯菌-噬菌體互作的“主戰場”從根際轉到外部干擾較小的植物莖部，增加噬菌體與青枯菌的接觸率和互作強度。盆栽試驗結果表明，相對于灌根法接種噬菌體，莖部注射能夠提高噬菌體對土傳青枯病的防控效果，達到37%以上。另外莖部注射噬菌體用量少、效率高，對開發低劑量高效率的噬菌體接種策略具有指導作用。

本探究獲得了一株高效抑制病原青枯菌的噬菌體NJ-P3，并進一步評估了其穩定性和防控效果。但根際的青枯菌基因型和生態型均呈現高度的多樣性，單一噬菌體的防控效果是有限的，利用更多抑菌效果好的噬菌體資源組合成噬菌體雞尾酒，或與有益微生物配合，多重措施協同，穩定高效阻控病原青枯菌。

4 結論

本研究從番茄根際分離純化了一株專性裂解病原青枯菌的短尾噬菌體NJ-P3。噬菌體NJ-P3對環境適應性強，能夠耐受20-50℃、pH為4-10、紫外線80 min照射；置于SM緩沖液中低溫（4℃）、常溫（25℃）下短期保存效果穩定。盆栽試驗結果表明，莖部注射噬菌體對土傳青枯病的防控效果達到86%。