婦科千金膠囊對小鼠脾淋巴細胞免疫活性的研究

徐佳 夏伯候 鄧靜 林麗美 何娟娟 吳夢瑤 龔云 雷磊

〔摘要〕 目的 研究婦科千金膠囊對小鼠脾淋巴細胞體外增殖及免疫調節的影響。方法 分離制備小鼠脾淋巴細胞，將細胞分為空白組（不做任何處理），刀豆蛋白A組（刀豆蛋白A干預，ConA組），LPS組（脂多糖干預，LPS組）及不同濃度的婦科千金膠囊組（FKQ），作用時間分別為24 h、48 h和72 h。CCK8法檢測FKQ對小鼠脾淋巴細胞體外增殖的影響;MTT法檢測ConA及LPS對脾淋巴細胞增殖的影響;流式細胞術檢測各組小鼠脾淋巴細胞中CD4+和CD8+的比例并計算CD4+/CD8+的比值;ELISA檢測各組細胞上清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的表達。結果 FKQ對小鼠脾淋巴細胞有顯著的增殖作用，以濃度為30、40、50 μg/mL時其作用越明顯（P<0.01）;FKQ能對ConA誘導的T淋巴細胞及LPS誘導的B淋巴細胞增殖有著明顯的促進作用，以濃度為50 μg/mL最顯著（P<0.01）;中、高濃度的FKQ協同ConA能升高CD4+的比例，降低CD8+的比例，顯著升高CD4+/CD8+的比值（P<0.01）。此外，不同濃度的FKQ均能明顯增加IFN-γ及IL-2的表達（P<0.01，P<0.05），降低IL-4和IL-10的水平，以中、高濃度最為顯著（P<0.01），調節Th1/Th2平衡。結論 婦科千金膠囊可有效促進脾淋巴細胞增殖，升高CD4+和CD8+比例，促進Th1細胞因子的分泌，使Th1/Th2亞群向“Th1漂移”，調節Th1/Th2平衡，提高細胞免疫應答。

〔關鍵詞〕 婦科千金膠囊;脾淋巴細胞;增殖;免疫調節;Th1/Th2

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.11.004

〔Abstract〕 Objective To study the effects of Fuke Qianjin Capsule （FKQ） on the proliferation and immunoregulation of mouse splenic lymphocytes in vitro. Methods After isolation and culture of mouse spleen lymphocytes， cells were assigned into a control group （no treatment）， a ConA group（intervention with ConA）， a LPS group（intervention with LPS） and Fuke Qianjin Capsule of different concentrations （FKQ）. They were treated for 24 h， 48 h and 72 h respectively. CCK8 assay was used to test the effects of FKQ on proliferation of spleen lymphocytes in vitro; MTT method was used to detect the effect of ConA and LPS on the proliferation of splenic lymphocytes; Flow cytometry was used to detect the proportion of CD4+ and CD8+ and calculate CD4+/CD8+ ratio. Moreover， IFN-γ， IL-2， IL-4 and IL-10 were detected by ELISA. Results FKQ at the concentrations of 30， 40 and 50 μg/mL significantly promoted the proliferation of splenic lymphocytes （P<0.01）. FKQ could significantly promote the proliferation of T lymphocytes induced by ConA and B lymphocytes induced by LPS， with the concentration of 50 μg/mL being the most significant （P<0.01）. The medium and high concentrations of FKQ cooperated with ConA increased the ratio of CD4+， decreased the ratio of CD8+， and significantly increased the ratio of CD4+/CD8+ （P<0.01）. Different concentrations of FKQ could significantly increase the expression of IFN-γ and IL-2 （P<0.01，P<0.05）， decreasethe levels of IL-4 and IL-10 （P<0.01）， to regulated the balance of Th1/Th2. Conclusion FKQ can promote the proliferation of splenic lymphocytes effectively， increase the proportion of CD4+ and CD8+， and promote the secretion of Th1 cytokines， thus shifting the Th1/Th2 subpopulation to "Th1"， thereby regulating the Th1/Th2 balance and improving cellular immune response.

〔Keywords〕 Fuke Qianjin Capsule; splenic lymphocytes; proliferation; immunoregulation; Th1/Th2

婦科千金膠囊（FKQ）是中國中藥保護品種，收載于2015版《中華人民共和國藥典》一部，由千斤拔、金櫻根、穿心蓮、單面針、功勞木、雞血藤、當歸、黨參8味中藥材組成，具有清熱除濕、益氣化瘀的功效。常用于濕熱瘀阻所致的帶下病、腹痛，癥見帶下量多、色黃質稠、臭穢、小腹疼痛、腰骶酸痛、神疲乏力等，既標本兼治，又扶正祛邪，臨床上廣泛用于婦科炎癥，療效甚佳。方中千斤拔祛風利濕解毒，金櫻根清熱利濕止帶，二者同為君藥;穿心蓮和功勞木清熱除濕，二者同為苦寒之品，合用使全方清熱解毒之力增強;單面針以其辛溫之性，可防穿心蓮、功勞木過于苦寒而傷胃，使全方藥性更趨平和，無傷正氣之虞，三者共為臣藥。當歸補血活血、調經止痛，雞血藤補血、活血、通絡，二者合用既能補血調經，又能暢利血行而加強全方清熱除濕、活血解毒之功能;黨參補中益氣、生津養血，與當歸、雞血藤合用氣血雙補、扶正固本，使全方融扶正、祛邪為一體，三者共為佐藥。諸藥合用使機體正氣得以充養，邪氣得以祛除，故諸癥消除。

中醫學十分重視人體的正氣，強調正氣是發病的主導，認為“正氣存內，邪不可干;邪之所湊，其氣必虛”。意指當人的正氣在內，氣血充足的時候，即機體免疫力正常，“外邪”即致病菌不容易侵犯機體致病;而當人體正氣受損，即免疫功能低下時，致病菌容易乘虛而入發病。FKQ的治療理念在清除致病菌的同時增強機體免疫力，后期通過強化自身免疫能力而防治疾病反復發作。脾臟作為機體最大的外周免疫器官，是T、B淋巴細胞的主要聚集場所，而T、B淋巴細胞作為機體免疫活性細胞，其激活、分化、增殖在免疫應答過程中起著重要的作用[1]。關于FKQ能調節由環磷酰胺引起的小鼠免疫功能障礙及FKQ組分中藥對機體免疫調節研究較多[2-5]，但尚無FKQ對體外培養小鼠脾淋巴細胞的免疫增強活性的報道。因此，本實驗以FKQ為研究對象，研究其對小鼠脾淋巴細胞的增殖及免疫調節的影響，以期為FKQ提高免疫作用機制的研究及開發利用奠定理論依據。

1 材料

1.1 ?實驗動物

20只健康BALB/c雌性小鼠，體質量16～18 g，6～7周齡，由湖南斯萊克景達實驗動物公司提供，許可證號：SCXK（湘）2019-0004。實驗動物飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心，自由飲食飲水，實驗程序由湖南中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準。

1.2 ?藥品與試劑

婦科千金膠囊（FKQ）（產品批號20170231，株洲千金藥業股份有限公司）;CCK8（CA1210，北京索萊寶科技有限公司）;胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（16000-044，美國gibco公司）;1640培養基（C11875500BT，美國gibco公司）;DMEM高糖培養基（SH30022.01，Hyclone公司）;ConA刀豆蛋白、LPS脂多糖及MTT噻唑蘭（批號分別為C8110、L8880、M8180，北京索萊寶科技有限公司）;Mouse IFN-γ、IL-2、IL-4及IL-10 ELISA Kit（批號為PI508、PI575、PI612、PI522，上海碧云天生物技術有限公司）。

1.3 ?儀器

47103離心機（Eppendorf中國有限公司）;SW-CJ-2FD蘇州凈化超凈工作臺（上海葉拓科技有限公司）、Blender 快速組織細胞破碎儀（美國 NextAdvance 公司）、Cyto-Flex 流式細胞儀（美國Beckman公司）。

2 方法

2.1 ?小鼠脾臟細胞的分離

將小鼠腹腔麻醉后，頸椎脫臼處死，75%酒精將小鼠浸泡15 min;在超凈臺中取出小鼠脾臟，去除筋膜后反復用PBS沖洗至無血色;將脾臟置于200目細胞篩上，注射器研磨，用PBS沖洗6次后置于培養皿中;收集細胞懸液，1 500 r/min離心10 min，棄上清;加入10%紅細胞裂解液適量，室溫靜置10 min，1 500 r/min離心10 min，棄上清;PBS清洗3遍，1 500 r/min離心10 min，棄上清;加入0.85%NaCl溶液重懸沉淀;密度梯度離心加樣，1 800～2 000 r/min離心40 min;收集目標分層，PBS清洗3遍;RPMI-1640完全培養基重懸細胞沉淀，調節細胞濃度為1×108，轉入培養瓶中37 ℃、5%CO2孵育3 h，去除貼壁細胞，收集懸浮細胞進行后續實驗。

2.2 ?CCK8法檢測FKQ對脾淋巴細胞的增殖作用

將FKQ設置成10、20、30、40、50 μg/mL，不同藥物濃度孵育小鼠脾淋巴細胞24 h、48 h和72 h。將處理完成的細胞制備細胞懸液，將1×104的細胞數接種到96孔板中，每孔約100 μL細胞懸液，每個濃度設3個復孔，培養12 h使其貼壁。每孔加入10 μLCCK8繼續培養1 h后，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度，吸光度值與細胞的增殖能力成正比。

2.3 ?MTT法檢測FKQ對ConA誘導脾淋巴細胞增殖的影響

細胞分離、接種方法同前，參考文獻[6]，本實驗分為空白組，模型組（ConA，5 μg/mL），FKQ組：不同濃度的FKQ（10、30、50 μg/mL）分別干預ConA誘導脾淋巴細胞。于37 ℃，5%CO2培養箱中作用24 h、48 h和72 h，MTT法檢測FKQ對ConA誘導脾淋巴細胞增殖功能，測定方法同CCK8法。

2.4 ?MTT法檢測FKQ對LPS誘導的脾淋巴細胞增殖的影響

細胞分離、接種方法同前，參考文獻[7]，本實驗分為空白組，LPS組（LPS，10 μg/mL），FKQ組：不同濃度的FKQ（10、30、50 μg/mL）分別干預LPS誘導的脾淋巴細胞。于37 ℃，5%CO2培養箱中作用24 h、48 h和72 h，MTT法檢測LPS誘導脾淋巴細胞增殖功能。

2.5 ?流式細胞術檢測小鼠脾淋巴細胞中CD4+和CD8+亞群的變化

將脾淋巴細胞（1×108）加入24孔板，設空白組、ConA組（ConA，5 μg/mL）和FKQ組：不同濃度的FKQ（10、30、50 μg/mL）分別干預ConA誘導脾淋巴細胞。每組均有3個復孔，置于37 ℃、5%CO2培養箱中，孵育48 h，離心收集細胞，磷酸鹽緩沖溶液清洗，然后使用小鼠單克隆抗體CD4+-FITC或者CD8+-FITC孵育后磷酸鹽緩沖溶液清洗，流式檢測CD4+和CD8+的百分比。

2.6 ?ELISA法檢測細胞上清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的含量

將脾淋巴細胞（1×108）加入96孔板，設空白組（不做任何刺激）、ConA組（ConA刺激）、LPS組（LPS刺激）和FKQ組：不同濃度的FKQ（10、30和50 μg/mL）分別干預ConA誘導脾T淋巴細胞和LPS誘導脾B淋巴細胞，每組均有3個復孔，置于37 ℃、5%CO2培養箱中，孵育48 h，收集細胞上清，2 000 r/min室溫離心5 min，取上清，按說明書操作，經酶標儀測定OD值。

2.7 ?統計學處理

使用SPSS 22.0統計學軟件整理數據，計量資料以“x±s”表示，當數據符合正態分布時，多組間比較使用單因素方差齊性分析（One-way ANOVA），當P<0.05時差異有統計學意義。

3 結果

3.1 ?FKQ對脾淋巴細胞的增殖作用

對小鼠脾淋巴細胞分別孵育24 h、48 h和72 h后，結果發現，當細胞孵育24 h，濃度為10、20 μg/mL的FKQ對小鼠脾淋巴細胞增殖無差異（P>0.05）;濃度在30、40、50 μg/mL時對細胞增殖有著顯著的促進作用（P<0.01）。當孵育細胞48 h，與濃度為10 μg/mL的FKQ相比，濃度在20、30、40、50 μg/mL時能明顯增加脾淋巴細胞增殖（P<0.01），且隨著劑量的增加其增殖作用越明顯。細胞孵育72 h后，30 μg/mL的FKQ對細胞增殖有促進作用（P<0.05）;40、50 μg/mL的FKQ對細胞增殖促進作用更為明顯（P<0.01）。其他濃度組的細胞存活率無顯著性差異，說明各濃度組藥物對細胞無明顯毒性。與培養24 h相比，FKQ濃度為10、30、50 μg/mL時，培養48 h與72 h，對小鼠脾淋巴細胞增殖無影響（P>0.05）;FKQ濃度為20、40 μg/mL時，培養48 h時能明顯促進細胞增殖（P<0.01）。見表1。

3.2 ?FKQ對ConA誘導脾T淋巴細胞增殖的影響

由表2可知，與ConA組相比，10～50 μg/mL的FKQ對T淋巴細胞的增殖具有顯著性差異（P<0.01），有顯著的量效關系，但只在24 h時劑量依賴性最明顯;細胞孵育48 h及72 h時，FKQ濃度在10 μg/mL和30 μg/mL時對細胞增殖作用差異較小，而當其濃度達到50 μg/mL時，其差異變化較大。

3.3 ?FKQ對LPS誘導脾B淋巴細胞增殖的影響

由表3可知，LPS在不同的孵育時間對B淋巴細胞都有明顯增殖促進作用;10～50 μg/mL的FKQ對B淋巴細胞的增殖存在明顯差異（P<0.05，P<0.01），在細胞孵育24 h及72 h時劑量依賴性最明顯;當細胞孵育24 h及72 h時，FKQ濃度在10 μg/mL和30 μg/mL時對細胞增殖作用差異較小，而當其濃度達到50 μg/mL時，其差異變化較大。當細胞孵育48 h時，FKQ濃度在10 μg/mL和30 μg/mL時對細胞增殖作用差異最大，濃度在50 μg/mL時，其差異最小。

3.4 ?FKQ對小鼠脾淋巴細胞中CD4+和CD8+亞群的影響

如圖1所示，與對照組相比，在ConA的刺激下，CD4+ T細胞比例顯著升高（P<0.01），而隨著FKQ的濃度升高CD4+ T細胞的比例出現增加的趨勢，但低濃度FKQ與ConA協同效果不明顯，而當FKQ達到中、高濃度時開始與ConA產生協同作用（P<0.01）;經ConA刺激后CD8+ T細胞比例降低;中、高濃度FKQ協同ConA能顯著升高CD4+/CD8+比值，調節機體免疫功能（P<0.01）。說明中、高濃度的FKQ與ConA能產生協同作用，調節機體免疫平衡。

3.5 ?FKQ對小鼠脾淋巴細胞INF-γ、IL-2、IL-4及IL-10表達的影響

表4結果顯示，與空白組相比，單用ConA和LPS刺激均能顯著增加IFN-γ、IL-2的含量，差異具有統計學意義（P<0.01，P<0.05）;與單用ConA及LPS刺激相比，ConA協同50 μg/mL FKQ能促進IL-2的表達，LPS協同不同濃度的FKQ對IFN-γ、IL-2的表達均有顯著促進作用（P<0.01），同時結果發現，與空白組相比，ConA及LPS的刺激顯著降低了細胞中IL-4的表達（P<0.01，P<0.05），而增加IL-10的表達（P<0.01）。與單用ConA及LPS刺激相比，FKQ協同ConA、LPS刺激均能降低IL-4、IL-10的表達，尤以中、高濃度最為顯著（P<0.01）。

4 討論

ConA是一種T淋巴細胞有絲分裂原，可刺激靜止的T淋巴細胞增殖活化;LPS是一種非胸腺依賴性抗原，可刺激B淋巴細胞增殖[8]。脾淋巴細胞中所含的T淋巴細胞及B淋巴細胞的增殖是機體細胞免疫最直接的反饋[9]。在本研究中，我們分離、培養正常小鼠脾淋巴細胞，采用ConA及LPS誘導刺激后，將不同濃度的FKQ進行協同干預，結果發現不同濃度的FKQ對小鼠脾淋巴細胞的增殖有著顯著的促進作用，而且無毒性。這表明FKQ可直接作用于免疫細胞，促進機體免疫細胞的活化、增殖功能，提高機體的免疫力。

外周成熟的T細胞只表達CD4+ T細胞和CD8+ T細胞，初始CD4+ T細胞接受抗原刺激后，在不同條件下分化成Th1細胞和Th2細胞。Th1主要分泌INF-γ、IL-2，INF-γ具有多種生物活性，能增強Th1細胞活性和細胞免疫功能[10];IL-2能促進T細胞分化、增殖，促進細胞毒T細胞的殺傷作用，增強NK細胞的活性，其分泌水平的高低代表著機體的免疫能力高低[11]。Th2主要分泌IL-4、IL-10等細胞因子，IL-4可促進活化的B細胞和T細胞增殖，是體液免疫和獲得性免疫的關鍵調節因子。IL-10能抑制Th1細胞產生IL-2和IFN-γ，阻礙Th1免疫應答[12]。

由于Th1和Th2細胞都能分泌細胞因子促進自身的增殖并抑制對方的增殖，因此，正常情況下機體中Th1細胞和Th2細胞處于平衡狀態。而Th1和Th2的失衡與許多疾病的發生密切相關。如王依靜等[13]研究發現盆腔炎患者血清IL-2及CD4+低于健康同齡婦女，而血清IL-4、IL-10及CD8+均高于健康者，且急性盆腔炎患者Th1/Th2的變化明顯大于慢性盆腔炎者，同時越嚴重的盆腔炎其變化越大。這與王娜研究提示慢性盆腔炎患者血清Th2細胞表達（血清IL-6的含量）比Th1細胞表達（血清IL-2含量）具有顯著優勢，即Th1/Th2平衡向Th2“漂移”，導致免疫功能失調結果一致[14]。伍麗芳[15]臨床發現FKQ可以顯著升高子宮內膜炎患者血清IL-2、IL-10的表達，而陳小寒發現其能明顯降低血清IL-4的水平，增加其抗炎活性，提高免疫應答[16]。而在本研究中發現，FKQ能明顯增加淋巴細胞上清中IFN-γ、IL-2的表達，降低IL-4及IL-10的表達，與伍麗芳研究結果相反。在炎癥后期，可檢測到血清IL-10的水平升高，高表達IL-10可負反饋激活Th2細胞，促進炎癥后期纖維化的發展[17]。而在炎癥早期，致病菌的感染，使促炎性因子升高，開始介導炎性反應，致炎因子和抗炎因子之間平衡被打破;而在炎癥發展過程中，抗炎因子開始逐漸上升，當炎癥發展到后期，促炎性因子表達被抑制，而抗炎因子反應增強，Th2細胞占主導作用，導致機體免疫抑制。因而，本研究結果提示FKQ能降低細胞上清IL-10的表達，與臨床上FKQ應用于炎癥后期、慢性后遺癥期一致。在炎癥后期，FKQ通過降低IL-10的釋放使Th1/Th2亞群向“Th1漂移”，抑制Th2的優勢表達，調節Th1/Th2平衡，提高細胞免疫應答。這與王依靜研究的盆腔炎發病的免疫機制及FKQ對慢性盆腔炎癥的免疫調節作用一致。

本研究結果表明FKQ可有效促進脾淋巴細胞增殖，促進ConA誘導的脾T淋巴細胞增殖及LPS誘導的B淋巴細胞增殖，增加CD4+比例，降低CD8+比例，升高CD4+/CD8+比值，提高機體免疫力。此外，FKQ能減少淋巴細胞向Th2型分化，促使Th1/Th2亞群向“Th1漂移”，抑制Th2的優勢表達，調節Th1/Th2平衡，提高細胞免疫應答。本實驗不足之處在于未明確FKQ中何種成分發揮主要免疫調節作用，未對FKQ調節免疫機能的作用機制進行探究，本課題組將在后續實驗中對不足之處進行完善。

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