SARS-CoV-2與SARS-CoV的主要生物學特性差異對研發防治COVID-19藥物的啟示

林秀蓮 王衛 覃麗 李凱 戴愛國 廖端芳

〔摘要〕 本文分析了2019年新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的基本構成、遺傳性狀、受體特征、蛋白切割位點、進入宿主細胞機制及引起細胞因子風暴等主要生物學特征，并與2003年“非典”病毒（SARS-CoV）進行比較，以期對研發防治COVID-19藥物有所啟示。

〔關鍵詞〕 SARS-CoV-2;SARS-CoV;生物學特性;致病原理;藥物研發

〔中圖分類號〕R259 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.11.023

〔Abstract〕 This paper tried to have an in-depth analysis of its basic composition， genetic traits， receptor characteristics， protein cleavage sites， mechanism of entering host cells and characteristics of cytokine storm of this novel coronavirus SARS-CoV-2， and its differences with SARS virus （SARS-CoV） in 2003， to provide some inspiration for the research and development of drugs for prevention and treatment of COVID-19.

〔Keywords〕 SARS-COV-2; SARS-CoV; biological characteristics; COVID-19; pathogenic mechanism; drug development

冠狀病毒（coronavirus）可引起嚴重呼吸道綜合征。新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）感染事件于2020年1月30日被世界衛生組織（WHO）宣布為“國際關注的突發公共衛生事件”[1]。截至2020年9月底，SARS-CoV-2感染所致的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）人數已超過3 000萬，導致的死亡人數已超過100萬，其對人類的影響遠超2003年爆發的“非典”（SARS）和2012年爆發的中東呼吸綜合征（MERS），目前尚無療效肯定、機制明確的抗病毒藥物，疫苗仍處于研究之中，全球抗疫形勢依然嚴峻，研發有效針對SARS-CoV-2病毒以防治COVID-19的藥物迫在眉睫。因此，本文分析了SARS-CoV-2與SARS-CoV的主要生物活性特性，并總結了其對研發防治COVID-19藥物啟示。

1 SARS-CoV-2和SARS-CoV的基本構成與差異

冠狀病毒是一大類病毒正向單鏈RNA基因組，基因組大約26 000-32 000個堿基，G+C含量在32%～43%之間[2]，其單鏈RNA可直接在細胞內表達蛋白。據系統進化分析，正鏈RNA冠狀病毒亞科由4個屬（？琢、？茁、？酌、？啄）組成，SARS-CoV-2屬于β冠狀病毒屬的亞屬（sungenus），為攜帶30 kb單個正鏈RNA基因組。RNA病毒的一個重要特征就是可通過變異產生新的變異株以逃避宿主防御，且可能存在逆向/返祖進化[3]。SARS-CoV-2與“非典”冠狀病毒（SARS-CoV）之間存在較大的遺傳距離，與MERS冠狀病毒的遺傳距離更大[4]。SARS-CoV-2的基因組是由29 891個堿基對組成，編碼9 860個氨基酸，SARS-CoV-2與SARS-CoV的核苷酸同源性為79.0%[5]，氨基酸同源性為75.80%[6]。

SARS-CoV-2基因組含有兩個開放閱讀框分別對應編碼pp1a和pp1ab兩種多蛋白前體蛋白，二者成熟后在維持基因組穩定和病毒復制中起關鍵作用。在SARS-CoV-2病毒全基因組核酸序列中，5'端相對比較保守，而3'端變異比較活躍[7]，其4種主要蛋白棘突蛋白S、包膜蛋白E、膜蛋白M和核衣殼蛋白N均位于基因組3末端的1/3處，故較易發生變異[8]。

SARS-CoV的S蛋白是影響受體結合和宿主特異性的關鍵蛋白之一。主要介導受體識別和膜融合，在病毒感染靶細胞過程中發揮重要作用。與SARS-CoV和中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）相比，SARS-CoV-2的S蛋白相對較長[9];且在N-末端有3個短片段插入，可分為S1和S2兩個部分[10]，S1含有一個受體結合域（receptor binding domain， RBD），可與細胞表面ACE2結合;S2含有兩個七肽重復序列HR1和HR2，參與病毒與宿主細胞膜的融合。其RBD內的受體結合基序有4個變化，均與SARS-CoV的S蛋白有差別[11]。此外，有文獻[12]報道SARS-CoV-2的S蛋白普遍存在D614G突變。

2 SARS-CoV-2和SARS-CoV進入宿主細胞的過程及機制差異性

SARS-CoV-2和SARS-CoV的復制過程和其他RNA病毒大多相似，基本包括棘突蛋白S識別宿主受體并附著、膜融合后入侵、脫殼放出遺傳物質、RNA復制、相關蛋白合成、病毒組裝和釋放等過程。冠狀病毒進入宿主細胞大多依賴受體介導，包括多肽類受體中的CEACAM1、APN、ACE2和DPP4等。研究證實人類ACE2是SARS-CoV-2的受體[13]。

2.1 ?SARS-CoV-2對宿主細胞ACE2受體及其結合域的識別

冠狀病毒通過表面S蛋白和宿主細胞ACE2受體識別并結合，進而發生膜融合實現入侵宿主細胞。ACE2受體屬于I型跨膜糖蛋白，其表達十分廣泛。ACE2高表達的組織如肺、心臟、腎、腸道等易受SARS-CoV-2的侵襲。文獻報道通過X射線衍射技術解析了SARS-CoV-2表面S糖蛋白受體結合區（RBD）與ACE2蛋白復合物的晶體結構，準確定位出兩者的相互作用位點，SARS-CoV-2的S蛋白C末端結合域（CTD）利用其外部子域識別ACE2受體中N末端結合域（NTD）的子域實現與ACE2受體結合[14]。

進一步研究發現，當病毒接觸到宿主細胞時，其表面S蛋白的2個亞基（S1和S2）處于亞穩態，然后S1蛋白包含的RBD的正電荷與ACE2受體的負電荷結合，形成融合蛋白并發生構象變化，RBD主要通過極性殘基被ACE2的肽酶結構域（PD）識別，每個PD可以容納一個RBD。此過程促進病毒膜和宿主細胞膜之間的融合，有利于核衣殼含有病毒的遺傳物質進入細胞質[15-16]。

實時表面等離子體共振（SPR）分析顯示，ACE2與SARS-CoV-2-CTD結合區之間的原子相互作用比SARS-CoV-RBD高約4倍[15]。最近文獻報道，在S蛋白所介導病毒進入細胞的過程中，ACE2和跨膜絲氨酸蛋白酶2（transmembrane serine proteinase 2， TMPRSS2）共表達是SARS-CoV-2進入宿主細胞的關鍵因素，TMPRSS2是棘突蛋白S的關鍵激活因子，TMPRSS2抑制劑就可阻斷SARS-CoV-2對肺細胞的感染[17]。除了ACE2受體和TMPRSS2外，Furin、GRP78、CD147和溶酶體蛋白酶也參與了病毒的導入。研究發現，SARS-CoV-2棘突蛋白可與宿主細胞上的受體CD147結合，從而介導病毒入侵[18]。ZHANG等[19]合成針對SARS-CoV-2棘突蛋白的多肽粘合劑，該多肽粘合劑通過與受體結構域結合，從而阻止病毒與ACE2相互作用。

2.2 ?冠狀病毒S蛋白切割與膜融合

膜融合通常發生在胞內體（endosomes），融合蛋白的構象轉變往往使埋藏的疏水融合肽從核心結構中暴露出來。融合肽插入宿主細胞質膜的外葉并啟動膜融合過程。一般情況下，病毒在成功附著到宿主細胞表面后，通過組織蛋白酶（如TMPRRS2等）進入宿主細胞內，這一過程依賴于Furin酶對S蛋白進行的切割[17，20]。SARS-CoV棘突蛋白S的切割發生在蛋白S2結構域的兩個不同位置，一個為 S1/S2 切割位點，另一個存在于S2近氨基端，稱為S2'蛋白酶切割位點。第一次切割有助于RBD和融合結構域的分離，第二次切割恰好暴露了位于S2'切割位點附近的內部融合肽。接著，S2中的兩個七肽重復序列連接在一起，形成一個六螺旋束結構。借助這種螺旋束結構導致的膜融合，病毒基因組被釋放到宿主胞漿中[21-22]。有文獻報道，SARS-CoV-2與SARS-CoV的S2'切割位點及緊隨其后的內部融合多肽（IFP）序列完全相同[20]。SARS-CoV-2的內部融合肽也與SARS-CoV相同，具有P1和P2堿性殘基，表明這兩種冠狀病毒具有共同的病毒融合和進入宿主細胞的機制[22]。

然而，與SARS-CoV的S蛋白切割位點不同的是，SARS-CoV-2病毒的S1/S2切割位點上還存在一個保守的Furin酶識別位點。Furin蛋白酶決定病毒進入宿主細胞的效率及其致病性。Furin蛋白酶識別位的存在也可能是SARS-CoV-2傳染性較高的另一個原因[23]。

2.3 ?冠狀病毒在宿主細胞內的復制過程

病毒經ACE2介導進入細胞質后，在其RNA依賴性RdRp聚合酶作用下，從3'開始復制。復制過程既可以產生連續性負鏈全基因組，也可以產生負鏈亞基因組RNAs（-sgRNAs），在這些負鏈RNA基礎上進一步合成正鏈全基因組RNAs 或sgRNAs。后者既可作為子代病毒基因組被組裝到病毒顆粒中，也可作為mRNAs模板合成病毒復制所需的調控蛋白及結構蛋白[24-25]。見圖1。

病毒基因組復制主要由病毒復制酶（如NSP3、NSP4、NSP6等）介導，同時還牽涉到多種其他酶類（如酪氨酸蛋白激酶、二氫乳清酸脫氫酶等）及宿主因素的參與。

SARS-CoV-2的主蛋白酶Mpro（或3CLpro）和RdRp聚合酶是兩個最重要的病毒靶點，新型冠狀病毒的復制復合物主要由病毒的非結構蛋白（non-structural protein， NSP）的多亞基轉錄復合物組成，核心成分主要是RNA依賴的RNA聚合酶催化亞基（NSP12），而NSP12的功能發揮也需要NSP7和NSP8兩個輔因子參與，它們的加入將促進NSP12與RNA模版的結合，同時也成為了核苷酸類似物例如瑞德西韋（Remdesivir）的作用靶標[25]。

NSP屬于冠狀病毒非結構蛋白，也是病毒復制的關鍵酶（RNA聚合酶催化亞基），由多蛋白前體ppla和pplab切割而成，可誘導宿主細胞膜重排形成雙膜小泡（DMV），后者為病毒復制轉錄復合物提供錨定場所。NSP3是最大的復制酶亞單位之一，被認為是通過插入宿主細胞膜并與NSP4、NSP6等相互作用，易發生點突變[8]，其中的木瓜蛋白酶（PLpro）[26]是參與SARS-CoV復制所必須的過程，因此被認為是開發抗病毒藥物的良好靶點。

3 SARS-CoV-2與SARS-CoV所致細胞因子風暴的差異性

促炎因子與抗炎因子之間的平衡是維持機體正常免疫功能和抵抗疾病的關鍵，也是抗COVID-19藥物研發的切入點之一。一般認為，非特異性炎癥細胞浸潤引起的肺組織損傷是急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）的核心病理改變，而局部細胞因子過度釋放是導致這種病理改變和臨床表現的決定性因素。SARS-CoV-2感染人體后，CD4+T淋巴細胞被激活，并產生粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）等細胞因子，進而誘導CD14+、CD16+炎性單核細胞過度激活，高度表達白介素-6（IL-6），加劇炎癥反應，在體內誘發細胞因子風暴[27]。早期研究表明，COVID-19患者血清中促炎細胞因子（IL-2、IL-6）水平與肺損傷及病情嚴重程度呈正相關[28]。細胞因子風暴也是導致COVID-19患者肺外組織器官損害和功能衰竭（如肝酶、肌酐升高等）的關鍵因素[29]。

SARS-CoV-2患者存在IL-1B、IFN-γ、IP-10和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的高表達。這些炎性因子可能激活輔助性T細胞1型（Th1）細胞反應[30]。Th1激活是特異性免疫激活的關鍵環節。SARS-CoV-2與SARS-CoV感染患者的不同之處在于前者還存在Th2型細胞分泌的抗炎癥因子（如IL-4和IL-10）水平升高。因此，SARS-CoV-2誘導細胞因子反應與SARS-CoV不同，調節炎癥反應、及時控制細胞因子風暴，是提高新冠肺炎患者治療成功率、降低死亡率的關鍵步驟。此外，SARS-CoV-2導致的宿主重要病理改變還包括較之其他冠狀病毒感染更為嚴重的T淋巴細胞下降、凝血系統障礙和內皮細胞損傷等。

4 防治COVID-19藥物的啟示

SARS-CoV-2與其同屬SARS-CoV相比，既有共性、也有其特殊性。可以根據冠狀病毒的共同生物學特性和與宿主相互作用的共同規律尋找藥物干預靶點，或者從已有抗病毒藥物中尋找防治COVID-19的藥物。我們對SARS-CoV-2病毒與宿主細胞相互作用不同階段的關鍵靶標進行了總結，詳見表1。

4.1 ?針對SARS-CoV-2識別/結合宿主細胞受體環節的藥物研發

阻斷病毒與宿主細胞的結合進入宿主細胞，一方面可以保護宿主免受病毒的感染;另一方面對已經被感染的個體，則能通過阻斷病毒從一個細胞進入另一個細胞的過程，可以達到快速清除體內病毒的效果。

ACE2為SARS-CoV-2進入人體細胞的關鍵靶標。目前，依賴于ACE2靶點阻斷SARS-CoV-2治療COVID-19的藥物研發可以選擇如下幾種策略：（1）篩選特異性化合物通過可溶性受體結合域（RBD）對ACE2受體進行結合阻滯。（2）通過ACE2的單鏈抗體或小分子核酸進行ACE2受體阻滯。（3）通過ACE2的嵌合人工抗體對SARS-CoV-2進行中和。（4）篩選特異性化合物調節ACE2受體功能（圖2）。已知SARS-CoV-2與人ACE2受體結合親和力的6個相應氨基酸為L455、F486、Q493、S494、N501和Y505。這些發現為基于ACE2靶向SARS-CoV-2識別的特異分子藥物篩選提供了重要的基礎。

除ACE2外，宿主CD147受體、TMPRSS-2、GRP78、Furin酶等均參與了SARS-CoV-2進入宿主細胞的過程，且在結構或功能上具有SARS-CoV-2靶向特異性，如Furin酶就可以針對SARS-CoV-2棘突蛋白S1/S2切割位點上特殊的Furin識別位點。針對SARS-CoV-2棘突蛋白的多肽黏合劑通過與受體結構域結合調控ACE2功能，也可阻止病毒與ACE2的相互作用。文獻報道，很多中藥活性成分如白藜蘆醇（resveratrol）、槲皮苷（quercetin）、木犀草素（luteolin）、柚皮素（naringenin）、姜黃素（curcumin）、沒食子酸（gallic acid）能抑制ACE2受體介導的SARS-CoV-2黏附作用[31]。因此，針對上述靶點從現有候選化合物或中藥中篩選特異性高、作用強的藥物，是應優先考慮的策略。如利用核酸適配體可望篩選出特異性針對ACE2、CD147受體、TMPRSS-2、GRP78、Furin酶等靶點的抗SARS-CoV-2的藥物。

4.2 ?針對SARS-CoV-2在宿主細胞內復制、組裝環節的藥物研發

針對SARS-CoV-2復制環節的藥物主要是蛋白酶抑制劑（如RNA聚合酶抑制劑、主蛋白酶Mpro/3CLpro抑制劑），包括核酸類似物、單克隆抗體、氯喹及其衍生物等（表2）。但冠狀病毒是病毒中種類最多，變異最快的病原體之一，因此，有待研發SARS-CoV-2針對性更強的抗病毒藥物，特別是針對RbRp、Mpro、3CLpro的強效特異抑制劑。

4.3 ?針對SARS-CoV-2誘導宿主炎癥反應及細胞因子風暴環節的藥物研發

炎癥應激、細胞因子風暴是COVID-19的嚴重病理改變。參與的炎癥因子包括IL-6、GM-CSF、MCP-1、IFN-r、IL-10、IL-4等。其中IL-6是最主要的致炎因子，IL-10和IL-4是主要的抗炎因子，應成為藥物研發的主要關注靶標。

IL-6在細胞因子釋放綜合征中起重要作用，IL-6受體阻滯劑Kevzara、托珠單抗（Tocilizumab）和GM-CSF抑制劑均能有效阻斷IL-6信號轉導通路，有望成為治療COVID-19的有效藥物[46]。

4.4 ?利用中藥資源研發治療COVID-19的特異性藥物

中醫藥在抗新冠病毒感染方面具有較獨特優勢。中醫藥《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第七版）》[47]建議：COVID-19屬于中醫學“疫”病范疇，病因為感受“疫戾”之氣，治療方案中醫學觀察期推薦中成藥如藿香正氣膠囊、金花清感顆粒、連花清瘟膠囊、疏風解毒膠囊，臨床治療期推薦以清肺排毒湯作為通用處方。文獻報道，中藥活性成分黃芩苷、槲皮苷具有抑制主蛋白酶（3CLpro）的作用[35]。

基于前面對SARS-CoV-2和SARS-CoV生物學特性的比較分析，在未來防治COVID-19新藥研發方面，也許可采用如下思路：（1）選擇具有明確抗病毒作用的經方或藥材，如清肺排毒湯、麻杏石甘湯、小柴胡湯、玉屏風散、大青龍湯、蓮花清溫顆粒、銀花清感膠囊等經方，或甘草、金銀花、黃芩、連翹、杏仁、陳皮、魚腥草、麻黃、板藍根、黃芪、柴胡、廣藿香、黃連等藥材，結合微流控質譜聯用高通量篩選技術，明確抗病毒有效成分類別或有效成分組合，并建庫。（2）采用核酸適配體技術，分別篩選建立針對病毒感染各環節關鍵靶標的核酸適配體庫和針對抗病毒中藥有效成分（特別是有效基團）的核酸適配體庫;利用GFP/mRFP雙熒光標記技術，結合大數據、云計算，對關鍵靶標與有效成分（特別是重要基團）、成分組合進行關聯性分析及驗證。（3）采用合成生物學技術，對從中藥中獲得的抗病毒作用肯定、作用靶點明確、分子結構特異但含量低微的有效成分，進行生源合成途徑解析，并探索生物合成（包括構建以植物細胞和工程菌為底盤的生物合成體系）的可能性。通過上述現代技術手段結合中醫藥學經典，研發出具有中醫藥特色的防治COVID-19的創新性藥物。并為未來可能出現的新的病原尤其是病毒類疾病的中藥研發，建立可借鑒的技術平臺，促進中醫藥現代化。

此外，針對SARS-CoV-2的單克隆抗體（特別是中和單克隆抗體）也是治療感染性疾病的一種新手段。目前，已有多個針對SARS-CoV-2的中和性單克隆抗體正在研究中，部分已開始Ⅰ期臨床試驗。包括：針對SARS-CoV-2棘突蛋白S的中和性單克隆抗體、可競爭性抑制S蛋白與CD147受體結合的人源化抗體美珀珠單抗以及托珠單抗[18，27]。

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