刺五加苷B對缺氧/復氧誘導的SD大鼠皮層神經元損傷的保護作用及其對PI3K/Akt信號通路的影響

鄧鳳春 王 濱 沈云虹 金香蘭 趙紅曄▲

1.齊齊哈爾醫學院解剖教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫學院生理教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006

缺血性腦卒中是最常見的卒中類型[1]；迄今，建立早期再灌注是唯一被認可的有效治療缺血性腦卒中的方法[2]。然而，缺血腦組織恢復血供后，往往又會引起更為嚴重的腦功能障礙[3]，即腦缺血/再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）。因此，開發針對CIRI的腦保護藥物對于缺血性腦卒中的防治具有重要的理論意義和臨床價值[4]。

刺五加苷B（eleutheroside B，EB）為刺五加的主要活性成分之一，具有保護神經、抗缺血的作用[5-6]，但其對CIRI的保護作用及機制尚不清楚。本研究探討EB對缺氧/復氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）誘導SD大鼠皮層神經元損傷的保護作用及其對PI3K/Akt信號通路的影響，為臨床防治缺血性腦卒中提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

24h新生SD大鼠，由齊齊哈爾醫學院實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK（黑）2018-001。所有的動物處置均嚴格按照國際倫理準則進行，并通過齊齊哈爾醫學院醫學倫理委員會批準。

1.2 試劑與儀器

刺五加苷B標準品（PCS0177）由北京中科質檢生物技術有限公司提供；Cell Counting Kit（CCK-8），日 本 Dojindo公 司 生 產；In situ cell death detection Kit，德國Roche公司生產；兔抗鼠cleaved-Caspase-3、Bcl-2、Bax、Akt/p-Akt抗體，美國CST公司生產；CO2常氧細胞培養箱和酶標儀，美國Thermo公司生產；電泳儀和電泳轉移儀，美國Bio-Rad公司生產。

1.3 方法

1.3.1 SD大鼠皮層神經元的提取、培養與鑒定 參照文獻報道的方法提取、培養和鑒定神經元，純度＞90%方可用于實驗[7]。

1.3.2 制備SD大鼠皮層神經元H/R損傷模型 取鋪滿單層SD大鼠皮層神經元的6孔培養板，吸棄原培養液，加入無糖DMEM培養液，每孔2mL；再加入Na2S2O4，使其終濃度為8mmol/L，培養4h；吸棄無糖且含Na2S2O4的DMEM，加入神經元維持培養液2mL，繼續培養24h[8]。

1.3.3 分組與給藥 取24h新生SD大鼠6只，提取皮層神經元，種植于6個六孔板中（方法同“1.3.1”）。將成熟且生長狀態良好的神經元隨機分為4組，即Control組、H4h/R24h組、EB25μg/mL組和EB50μg/mL組，每組9個孔。Control組經神經元維持培養液培養孵育4h后，更換培養液繼續孵育24h；H4h/R24h組處理方法見“1.3.2”；EB25μg/mL組和EB50μg/mL組則先用相應濃度的EB預保護3h，再造模。

1.3.4 CCK-8法測定神經元細胞活力 每孔加入培養液10%體積的CCK-8試劑，37℃孵育3h；將各孔內液體按組別分別加入96孔板中，在酶標儀波長450nm處測量各孔的OD值。設3個復孔，計算細胞活力。

1.3.5 TUNEL法檢測神經元細胞凋亡率 按照檢測試劑盒說明書處理神經元，熒光顯微鏡下觀察并拍照（每個樣本隨機選取5個非重疊高倍視野）。設3個復孔，計算凋亡率。細胞凋亡率=凋亡神經元個數/神經元總數×100%。

1.3.6 Western blotting法檢測神經元中cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2、Akt和 p-Akt蛋白表達水平 用RIPA裂解液提取神經元蛋白質；BCA法檢測蛋白濃度；制備聚丙烯酰胺凝膠；經過上樣、電泳、轉膜和封閉，加入一抗，以β-actin為內參照，4℃孵育過夜；加入二抗，室溫孵育1h；加入ECL發光液發光。實驗重復三次，采用Quantity One軟件測量各組蛋白條帶灰度值，計算目標蛋白表達水平。

1.4 統計學處理

本研究應用SPSS22.0統計學軟件分析數據，計量資料以（）表示，實驗重復三次；進行One-Way ANOVA方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EB對H/R損傷SD大鼠皮層神經元細胞活力的影響

與Control組比較，H4h/R24h組神經元細胞活力降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。與H4h/R24h組比較，EB25μg/mL組和EB50μg/mL組神經元細胞活力明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05），且細胞活力隨著EB作用濃度的增加而增高；提示EB與SD大鼠皮層神經元細胞活力有一定的量效關系，能夠抑制神經元的H/R損傷，見圖1。

圖1 EB對H/R損傷SD大鼠皮層神經元細胞活力的影響（n=3）

2.2 EB對H/R損傷SD大鼠皮層神經元凋亡率的影響

與Control組比較，H4h/R24h組神經元凋亡率升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。與H4h/R24h組比較，EB25μg/mL組和EB50μg/mL組神經元凋亡率明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 EB對H/R損傷SD大鼠皮層神經元凋亡率的影響（n=3）

2.3 EB對H/R損傷SD大鼠皮層神經元cleaved-Caspase-3蛋白表達水平和Bax/Bcl-2比值的影響

與Control組比較，H4h/R24h組神經元cleaved-Caspase-3蛋白表達水平和Bax/Bcl-2比值均升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。與H4h/R24h組比較，EB 25μg/mL組和EB 50μg/mL組神經元cleaved-Caspase-3蛋白表達水平和Bax/Bcl-2比值均降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

2.4 EB對H/R損傷SD大鼠皮層神經元p-Akt蛋白表達水平的影響

與Control比較，H4h/R24h組神經元p-Akt蛋白表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。與H4h/R24h組比較，EB25μg/mL組神經元p-Akt蛋白表達水平升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）；而EB50μg/mL組神經元p-Akt蛋白表達水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4。

3 討論

神經元凋亡是CIRI發生的主要機制之一，因此抑制缺血腦組織神經元的凋亡可有效改善CIRI[9]。EB是從刺五加的根、莖中提取的一種具有神經保護作用的活性成分[10]。本研究采用原代培養的SD大鼠皮層神經元建立H/R損傷模型，結果顯示EB能夠抑制H/R介導的神經元凋亡，增加神經元的細胞活力，具有神經保護作用。

圖3 EB對H/R損傷SD大鼠皮層神經元cleaved-Caspase-3蛋白表達水平和Bax/Bcl-2比值的影響

圖4 EB對H/R損傷SD大鼠皮層神經元p-Akt蛋白表達水平的影響

Caspase家族和Bcl-2家族是重要的細胞凋亡調節因子[11]。Caspase家族成員介導的蛋白酶級聯反應是細胞凋亡的中心環節[12]，其中Caspase-3是細胞凋亡的最終執行者[13-14]。Caspase-3接受凋亡信號而被剪切激活，隨即啟動下游的級聯反應而引發凋亡[15]。研究表明，抑制Caspase-3的激活和表達可有效地切斷神經元的凋亡過程[16-18]。Bax和Bcl-2是Bcl-2家族中一對相互拮抗的凋亡調節蛋白，Bax促進凋亡，而Bcl-2抑制凋亡[19-20]。接受凋亡信號刺激后，Bax分子構象改變，移位、插入到線粒體外膜上，破壞線粒體膜并對抗Bcl-2，促進凋亡的發生[21]。Bcl-2還可抑制線立體細胞色素C的釋放，阻止Caspase的激活，抑制凋亡的發生[22]。因此，Bax/Bcl-2比值是決定細胞存亡的關鍵。本研究結果顯示，H/R損傷的SD大鼠皮層神經元中Bax/Bcl-2比值增大，最終激活Caspase-3，引起神經元凋亡；而EB預保護可恢復神經元中的Bax/Bcl-2比值，抑制Caspase-3活化；提示EB通過抑制細胞凋亡發揮其減輕H/R誘導神經元損傷的作用，與凋亡線粒體途徑相關的Bcl-2家族蛋白可能與EB的抗凋亡作用有關。

PI3K/Akt信號通路是蛋白質合成的重要信號轉導通路，主要由PI3K和Akt組成。一旦PI3K被激活，可將Akt磷酸化為p-Akt，而p-Akt則可啟動下游的級聯反應，進一步磷酸化Bad、Caspase-3等，對抗細胞凋亡[23-24]。本研究結果顯示，H/R損傷的SD大鼠皮層神經元p-Akt蛋白表達水平升高，而EB預保護可使神經元p-Akt蛋白表達水平進一步升高；提示H/R損傷可激活神經元中的PI3K/Akt信號通路，這可能是神經保護的代償性作用之一；而EB可提高神經元中PI3K/Akt信號通路的激活程度，以進一步發揮神經保護作用。

綜上所述，EB對H/R誘導的SD大鼠皮層神經元損傷具有神經保護作用，其作用機制可能與促進PI3K/Akt信號通路的激活、抑制神經細胞凋亡有關。