IFN-γ在多囊卵巢綜合征中的表達(dá)及對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的影響

張麗娜，王娟，姚雪，李春梅，史兵偉，夏圣

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.常州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 常州 213003)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種常見的內(nèi)分泌激素紊亂性疾病，多發(fā)于育齡期女性。臨床上PCOS患者主要以高雄性激素、肥胖、多毛、不孕為主要特點(diǎn)，同時(shí)患者常伴有月經(jīng)紊亂、卵巢功能失衡。卵巢顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞關(guān)系十分密切,可供給卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育所需的85%的營養(yǎng)[1]，影響著卵泡的啟動(dòng)、發(fā)育、成熟及閉鎖。有研究表明，高雄激素可抑制顆粒細(xì)胞的增殖及卵母細(xì)胞的成熟[2]。Nehir等[3]發(fā)現(xiàn)炎癥因子與PCOS患者的高雄激素血癥密切相關(guān)。研究表明，PCOS患者體內(nèi)有部分炎癥因子表達(dá)水平明顯上調(diào)[4-6]。但是，炎性因子對(duì)顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的影響及在PCOS發(fā)病中的作用還不明確。本研究擬檢測(cè)PCOS患者外周血中炎癥因子IFN-γ的表達(dá)水平，并探討IFN-γ對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞增殖、凋亡的影響，以期探究IFN-γ在PCOS疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 標(biāo)本采集 收集31例2016年11月至2017年6月在常州市中醫(yī)醫(yī)院初診、年齡為21～34歲的PCOS患者和22例年齡匹配的健康志愿者血液標(biāo)本。所有PCOS患者的診斷都符合鹿特丹診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：① 低排卵/無排卵；② 臨床癥狀和(或)生化檢查表現(xiàn)為高雄激素血癥；③ 超聲顯示多囊卵巢的存在，符合3 項(xiàng)中的2項(xiàng)，并排除如先天性腎上腺增生、非經(jīng)典腎上腺增生、庫欣綜合征、分泌雄激素腫瘤、特發(fā)性雄激素過多癥、特發(fā)性多毛癥，高催乳素血癥和甲狀腺疾病等其他疾病。健康志愿者符合以下條件：① 有規(guī)律的月經(jīng)周期；② 性激素水平正常；③ 無代謝性或炎癥性疾病。所有受試者均未接受治療。本研究獲常州市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過，患者及家屬均知情并簽署知情同意書。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及試劑 人卵巢顆粒細(xì)胞瘤KGN細(xì)胞(上海江林生物科技有限公司)；人IFN-γ(上海達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞刺激劑試劑盒(Leuko Act Cktl with GolgiPlug)、抗CD3-FITC、抗CD8-PerCP-cy5.5、抗IFN-γ-PE、抗IL-4-APC、人Th1/Th2細(xì)胞因子試劑盒(美國BD公司)；Fix &Perm破膜劑(美國Nordicmubio公司)；細(xì)胞周期試劑盒(上海前塵生物科技有限公司)；APC-Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(福麥斯生物技術(shù)有限公司)；羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)細(xì)胞增殖試劑盒(美國Thermo公司)；RPMI-1640、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(美國 Gibco 公司)；青鏈霉素混合液(美國Sigma公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

KGN細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗(100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素混合液)的DMEM/F12培養(yǎng)液中，細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h換1次新鮮培養(yǎng)液。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離制備

PCOS患者和對(duì)照組肝素抗凝肘靜脈血，3 500 r/min常溫離心5 min，收取血漿并于-80 ℃保存。余下細(xì)胞加入等體積的PBS稀釋，輕輕顛倒混勻后，輕柔逐滴滴入到預(yù)先加入的等體積Ficoll淋巴細(xì)胞分離液液面上，2 000 r/min常溫離心20 min。吸取PBMC所在細(xì)胞層的細(xì)胞，轉(zhuǎn)入新離心管中，加入PBS，2 000 r/min離心10 min洗滌。共洗滌3次，去上清液后，將細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 流式細(xì)胞儀分析Th1、Th2細(xì)胞

將細(xì)胞計(jì)數(shù)后，接種于24孔板內(nèi)，每孔加細(xì)胞刺激劑，給予5 h刺激后，收集細(xì)胞；PBS清洗后依次加入抗CD3-FITC、抗CD8-PerCP-cy5.5抗體，染色30 min；PBS清洗后，加破膜劑試劑A，室溫靜置15 min；PBS清洗后，加入破膜劑試劑B和抗IFN-γ-PE、抗IL-4-APC抗體，染色45 min；PBS清洗后加入200 μL PBS，上流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，美國BD公司)檢測(cè)。用CD3+、CD8-抗體反圈門，CD3+CD8-IFN-γ+的細(xì)胞為Th1細(xì)胞，CD3+CD8-IL-4+的細(xì)胞為Th2細(xì)胞。設(shè)置同型對(duì)照用于消除抗體與細(xì)胞非特異性結(jié)合所產(chǎn)生的背景染色。數(shù)據(jù)采用Flowjo軟件進(jìn)行分析。

1.5 血漿中IL-4、IL-6、IFN-γ的表達(dá)水平流式細(xì)胞儀CBA法檢測(cè)

血漿中細(xì)胞因子的檢測(cè)采用流式細(xì)胞小球微陣列術(shù)(cytometric bead array,CBA)法。首先制備混合微球液，流式EP管中依次加入50 μL預(yù)處理好的混合微球液、50 μL的樣本和各濃度標(biāo)準(zhǔn)品、50 μL的藻紅蛋白熒光抗體，充分混勻，室溫避光孵育3 h。每管加1 mL 緩沖液，1 800 r/min離心5 min；棄上清液，最后加入120 μL 緩沖液，混勻后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)曲線用FACS Array3.0分析軟件繪制，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出血漿中各種細(xì)胞因子的濃度。

1.6 CFSE標(biāo)記法檢測(cè)KGN細(xì)胞增殖

培養(yǎng)KGN細(xì)胞，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，用PBS調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至2×106/mL。將調(diào)整好細(xì)胞密度的單細(xì)胞懸液與等體積CFSE工作液混合，使CFSE的終濃度為 2.5 μmoL/L，充分混勻后，避光、室溫靜置10 min。加入含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液終止反應(yīng)，1000 r/min離心5min，棄上清液；加入PBS 1000r/min離心5 min，棄上清液，共洗滌細(xì)胞2次。將CFSE標(biāo)記的KGN細(xì)胞懸液以每孔6×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)1～2 d后，待細(xì)胞生長(zhǎng)至合適密度時(shí)，將KGN細(xì)胞分為對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng))和干擾素處理組(加入250 ng/mL IFN-γ)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集兩組細(xì)胞。分別加入2 μL 7-AAD染色液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)7-AAD陰性的KGN細(xì)胞增殖情況。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

培養(yǎng)KGN細(xì)胞，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)消化收集細(xì)胞，每孔以5×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)預(yù)培養(yǎng)1～2 d。將KGN細(xì)胞分為對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng))和干擾素處理組(加入250 ng/mL IFN-γ)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集兩組細(xì)胞并用PBS洗滌2遍。分別加入2 mL 70%冷乙醇固定細(xì)胞，輕輕混勻，4 ℃過夜。1 500 r/min離心5 min，去除固定液，加預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，洗滌2～3次。依次加入100 μL細(xì)胞周期試劑A、100 μL試劑B和150 μL試劑C，輕柔混勻，室溫放置15 min。檢測(cè)前用300目尼龍篩網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IFN-γ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

培養(yǎng)KGN細(xì)胞，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，消化收集細(xì)胞以每孔6×104個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板內(nèi)，將KGN細(xì)胞分為對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng))和干擾素處理組(加入250 ng/mL IFN-γ)，分別在0、24、48、72 h顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，確定流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡的最適時(shí)間。收集對(duì)照組與干擾素處理組處理48 h后的細(xì)胞，并用PBS洗滌2遍，加250 μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞使其終濃度為1×106/mL。取100 μL細(xì)胞懸液，加入2.5 μL Annexin V/Alexa Fluor 647、5 μL 20 μg/mL的碘化丙錠溶液，混勻、避光孵育15 min，加400 μL PBS上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PCOS患者的超聲診斷特征

超聲可見PCOS患者至少一側(cè)卵巢存在≥12個(gè)直徑為2～9 mm的小卵泡，和(或) 卵巢體積>10 cm3。見圖1。

圖1 健康志愿者和PCOS患者卵巢超聲影像

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PBMC中Th1、Th2細(xì)胞比例

與對(duì)照組相比，PCOS患者血漿中Th1比例明顯上調(diào)，Th2細(xì)胞的比例差異不明顯(圖2A、2B)。結(jié)果顯示，PCOS患者血漿中Th1的比例較對(duì)照組明顯升高(t=9.506，P<0.01)；而Th2細(xì)胞在兩組中的比例無明顯差異(圖2C、2D)。

A：Th1細(xì)胞流式分析；B：Th2細(xì)胞流式分析；C：PBMC中Th1細(xì)胞結(jié)果分析；D：PBMC中Th2細(xì)胞結(jié)果分析圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PCOS患者外周血中Th1、Th2細(xì)胞比例

2.3 血漿中IL-4、IL-6、IFN-γ的流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)

結(jié)果顯示，兩組IL-4比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PCOS組IL-6和IFN-γ水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.029，P<0.01；t=-2.306，P<0.05)。見圖3。

圖3 流式細(xì)胞儀CBA法檢測(cè)PCOS患者血漿中IL-4、IL-6、IFN-γ水平

2.4 IFN-γ對(duì)KGN細(xì)胞增殖的影響

流式分析時(shí)，先對(duì)KGN細(xì)胞設(shè)門分析，去除樣本中的細(xì)胞碎片；再對(duì)7-AAD陰性細(xì)胞設(shè)門，以排除死細(xì)胞的影響，繼而分析KGN細(xì)胞CFSE的熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，干擾素處理組KGN細(xì)胞的增殖較對(duì)照組右移，表明KGN細(xì)胞在加入干擾素處理后可抑制KGN細(xì)胞的增殖。見圖4。

圖4 KGN細(xì)胞增殖的CFSE流式細(xì)胞儀檢測(cè)

2.5 IFN-γ對(duì)KGN細(xì)胞周期影響

流式分析時(shí)，先對(duì)KGN細(xì)胞設(shè)門，去除細(xì)胞碎片；再對(duì)細(xì)胞周期分析的單細(xì)胞群體設(shè)門，去除黏連細(xì)胞，繼而分析單細(xì)胞中處于各細(xì)胞周期的細(xì)胞比例。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，干擾素處理的KGN細(xì)胞中處于G0-G1期細(xì)胞比例增加，S期和G2-M期細(xì)胞比例均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。表明KGN細(xì)胞在加入干擾素處理后，細(xì)胞周期被阻滯在G0-G1階段。見圖5。

圖5 IFN-γ對(duì)KGN細(xì)胞周期影響

2.6 IFN-γ對(duì)KGN細(xì)胞凋亡的影響

使用250 ng/mL IFN-γ對(duì)KGN細(xì)胞處理24 h后，干擾素處理組與對(duì)照組比較無明顯差異；處理48 h后，與對(duì)照組相比，干擾素處理組細(xì)胞增殖的速度和密度降低；處理72 h后，干擾素處理組細(xì)胞密度明顯降低，細(xì)胞發(fā)生退化現(xiàn)象。收集培養(yǎng)48 h細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平，流式分析結(jié)果顯示，處理48 h后，干擾素處理組早期凋亡比例與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干擾素處理組晚期凋亡比例與對(duì)照組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-11.667，P<0.01)。見圖6。

A：IFN-γ刺激KGN細(xì)胞不同時(shí)間后的細(xì)胞形態(tài)觀察(×40)；B：IFN-γ刺激KGN細(xì)胞48 h細(xì)胞凋亡圖6 IFN-γ對(duì)KGN細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

PCOS是一種育齡期女性的內(nèi)分泌紊亂性疾病，影響著5%～10%的女性身體健康，給處于生育期的婦女帶來了極大的困擾[8]。研究表明，PCOS患者IL-6、PAI-1、CRP、TNF-α等炎癥因子表達(dá)水平升高[9-10]；Qin等[11]發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵泡液中IFN-γ、IL-2細(xì)胞因子水平明顯上調(diào)。本研究通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)PCOS患者和健康對(duì)照組外周血中Th1、Th2型細(xì)胞的比例，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PCOS患者外周血中IFN-γ+Th1型細(xì)胞比例明顯上調(diào)，IL-4+Th2型細(xì)胞比例則無明顯差異。Gong等[12]在研究PCOS婦女Th1/Th2免疫失衡與肥胖的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，PCOS患者體重指數(shù)和腰圍升高時(shí)，Th1/Th2比值升高，PCOS患者全身免疫向Th1免疫轉(zhuǎn)移。Nasri等[13]研究不育PCOS患者體內(nèi)Th細(xì)胞之間的平衡關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，Th細(xì)胞免疫平衡的改變可能導(dǎo)致不孕。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、先兆子癇等妊娠并發(fā)癥患者Th1升高、Th2應(yīng)答降低[14-15]。

本研究結(jié)果顯示，PCOS患者血漿中IFN-γ水平升高，與最近有學(xué)者發(fā)現(xiàn)的PCOS患者血清中IFN-γ水平低于對(duì)照組的結(jié)果存在偏差，可能是由于不同研究所選患者的疾病進(jìn)程及患者入組時(shí)的條件差異所致。Xie等[17]通過PCOS鼠模型發(fā)現(xiàn)，PCOS小鼠脾臟IFN-γ+Th細(xì)胞比例以及IFN-γ+CD19+B細(xì)胞比例增加，子宮及卵巢組織中IFN-γ的表達(dá)水平升高，本研究結(jié)果與其一致。PCOS患者常見的臨床特征有胰島素抵抗、高雄激素血癥及卵巢功能紊亂等，炎癥因子介導(dǎo)的信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過阻滯胰島素受體酪氨酸激酶活性，誘導(dǎo)胰島素抵抗的形成，繼而干擾肝臟性激素結(jié)合球蛋白合成，間接引起高雄激素血癥[18-19]。也有研究表明，炎癥細(xì)胞因子水平與PCOS患者體內(nèi)下丘腦-垂體-性腺軸平衡密切相關(guān)，可通過影響性激素分泌，阻滯卵泡發(fā)育和排卵[20]。

Th1細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的一個(gè)亞群，活化后可分泌包括IFN-γ在內(nèi)的多種促炎因子，在自身免疫性內(nèi)分泌疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α能抑制人顆粒細(xì)胞增殖，誘發(fā)顆粒細(xì)胞凋亡[22]。本研究結(jié)果表明，IFN-γ不但抑制KGN細(xì)胞增殖，也可誘導(dǎo)KGN細(xì)胞凋亡。在整個(gè)卵母細(xì)胞發(fā)育過程中，圍繞卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞主要提供卵母細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[23]。若顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡，可能會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞核成熟延遲[24]。PCOS患者因“促卵泡刺激素-顆粒細(xì)胞軸”功能低下、顆粒細(xì)胞凋亡、芳香化酶功能低下不能將卵泡內(nèi)膜細(xì)胞合成的雄激素轉(zhuǎn)化成雌二醇,從而引起體內(nèi)雄激素積累過多、卵泡發(fā)育中途停滯，最終導(dǎo)致優(yōu)勢(shì)卵泡選擇發(fā)生障礙。PCOS患者體內(nèi)有較多直徑為2～9 mm的竇卵泡停止生長(zhǎng)，使卵巢形成多囊狀改變。

綜上所述，PCOS患者體內(nèi)IFN-γ水平上調(diào)，IFN-γ可抑制KGN細(xì)胞增殖并促進(jìn)KGN細(xì)胞凋亡。因此，T細(xì)胞介導(dǎo)的活化及其分泌的IFN-γ可能在PCOS發(fā)病中起一定作用，為PCOS的診斷與治療提供了理論依據(jù)。