加速康復外科圍術期營養管理對胃切除術后腸黏膜屏障的影響

呂季陽，李紅，韓賀，馮樂，陳吉祥

(1.江蘇大學附屬醫院普外科，江蘇 鎮江 212001；2.江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013)

加速康復外科(enhanced recovery after surgery,ERAS) 理念由丹麥Kehlet教授于1997年提出[1]，最早應用于結直腸手術中。隨后，ERAS理念逐步拓展應用于普外科的幾乎所有臟器手術，而關于胃切除術的ERAS研究起步稍晚。目前已有的研究多以說明ERAS理念應用于胃切除術安全、有效，可促進腸蠕動，有利于術后腸功能恢復且并不增加術后并發癥等[2-3]，而有關胃切除術對腸屏障結構的影響尚不清楚。本文通過檢測全胃切除術實施ERAS營養管理患者的腸屏障功能，再制作大鼠胃切除模型并按ERAS營養管理要求進行營養管理，觀察其腸黏膜屏障的形態學結構變化，以期探討ERAS圍術期營養管理對胃切除術腸屏障結構和功能的影響。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對象 選擇2017年9月至2019年10月江蘇大學附屬醫院普外科收治的42例胃癌患者，均行腹腔鏡全胃切除術，隨機分成兩組：ERAS組(按ERAS理念進行圍術期營養管理)22例，47～69歲；傳統組(按傳統理念進行圍術期營養管理)20例，39～70歲。入選標準：年齡≤70歲；術前未接受過化療；均接受擇期D2手術治療；患者接受并簽訂知情同意書。排除標準：姑息、急診手術；需要聯合切除脾或胰腺的患者；胃腸梗阻者；有心功能不全、肝硬化、膽囊炎、膽結石和糖尿病病史。本研究經江蘇大學附屬醫院醫學倫理委員會審批，審批號2016-035。

兩組患者年齡、性別、腫瘤大小、位置及TNM分期比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較

1.1.2 主要藥品、試劑和儀器 腸內營養液，紐迪希亞制藥有限公司(無錫)；腸外營養液(1 440 mL，1 000 kcal)，華瑞制藥有限公司(無錫)；麥芽糊精果糖飲品，商品名素乾，江蘇正大豐海制藥有限公司(連云港)。人二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)、人D-乳酸及人腸脂肪酸結合蛋白(IFABP)ELISA試劑盒為博智科生物(蘇州)產品。微量輸液泵ZD-50F6(蘇州澤德醫療器械有限公司)；全波長酶標分析儀Multiskan GO(上海巴玖實業有限公司)；透射電子顯微鏡(型號JEM-1400 PLUS)為日本電子株式會社(東京)產品。

1.1.3 圍術期營養管理 ERAS組按文獻[4]進行營養管理。術前未常規進行腸道準備；術前12 h禁食，術前6 h及2 h分別口服素乾400 mL和200 mL。術后麻醉清醒后即可飲水(飲水量小于25 mL/h)。術后12 h從鼻腸管滴注5%葡萄糖氯化鈉注射液，20～40 mL/h，24 h后如腸道能適應，給予鼻腸管注入腸內營養液，開始20 mL/h逐日增至80～100 mL/h，維持7 d過渡至正常飲食。熱量開始500～600 kcal/d，逐漸增加至30 kcal/(kg·d)。術后前幾天由腸內營養供給的熱量和液體量不足，可由靜脈補充10%葡萄糖和復方氨基酸溶液，直至全胃腸內營養。總液體量2 300～2 500 mL。傳統組按傳統圍術期管理理念進行處理。術前一天晚間灌腸，術前12 h禁食禁飲。術后禁食禁飲，術后第1天行靜脈營養，輸入腸外營養液，靜脈供給熱量30 kcal/(kg·d)，總液體量2 300～2 800 mL，術后7 d過渡至正常飲食。

1.1.4 樣本采集 患者于術前、術后1、3、5 d取空腹肘靜脈血4 mL于EDTA抗凝管；2 h內離心，3 000 r/min離心10 min，取血漿分裝，-70 ℃保存。

1.2 動物分組和胃切除模型制備

1.2.1 實驗動物 健康成年雄性清潔級SD大鼠，體重250～300 g，由江蘇大學實驗動物中心提供，動物許可證號為SCXK(蘇)2019—0021，于普通實驗室適應性飼養1周，自由進食飲水。

1.2.2 動物分組 50只大鼠隨機分為3組。ERAS組：大鼠全胃切除+腸內營養，20只；傳統組：大鼠全胃切除+腸外營養，20只；對照組：10只，常規飼養，自由進食飲水。

1.2.3 胃切除模型制備 ERAS組：腹腔注射氯胺酮(10 mg/100 g)后，腹部正中切口逐層進腹腔，取下胃組織，吻合食管和十二指腸斷端。在空腸壁(距十二指腸懸韌帶15 cm處)，用絲線作環狀荷包縫合，置入采血針塑料導管(用作腸內營養管)，插入空腸內約2 cm，縫合固定。在距腹部切口外側0.5 cm的腹肌處剪一小洞，導管另一端由此出腹腔，并由此鈍性分離皮膚與皮下組織成一條通道至頸背部，切一小口，導管經通道從頸背部引出。腹肌及皮下組織單純連續縫合，皮膚單純間斷縫合關閉腹腔。作為假手術損傷，于頸部正中切口，分離大鼠右側頸內靜脈約0.5 cm，將頸內靜脈結扎，分層縫合頸部切口。將術后大鼠安置于鼠籠，并連接塑料管與微量注射泵。

傳統組：行全胃切術后，縫合食管和十二指腸斷端。作為假手術損傷，在空腸壁(位置同ERAS組)作一小切口，絲線縫合，同時縫合腹部切口。再作頸前區切口，分離右側頸內靜脈約1 cm，結扎遠心端，在近心端置入充滿肝素液的靜脈留置針(22 G)至上腔靜脈，用絲線將置管固定并由頸部切口引出，縫合切口。將術后大鼠置于籠內，將靜脈管連接微量輸液。

1.2.4 營養供給方案 兩組大鼠均于術前12 h禁食，ERAS組于術前6 h供給素乾3 mL。兩組均于術后6 h供給營養，熱能按每天30 kcal/kg計算。ERAS組每天注入腸內營養液量(mL)=30 kcal·kg-1×體重(kg)/(1 kcal·mL-1)，傳統組每天注入腸外營養液量(mL)=30 kcal/kg×體重(kg)/(0.69 kcal·mL-1)。每天液體供給量30 mL，不足部分加注射用水補充，以微量注射泵勻速于24 h內輸入。其間大鼠禁食不禁飲。為防止營養管堵塞，腸內營養管堅持每天用0.9% NaCl溶液沖洗，腸外營養管每12 h予肝素生理鹽水沖洗。

1.2.5 標本采集 兩組于術后24 h、72 h分兩批處理并取腸組織，每批10只。對照組10只，于常規飼養1周后腹腔注射氯胺酮(10 mg/100 g)麻醉，打開腹腔，于距離回盲部5 cm處切取回腸腸管約2 cm，用0.9% NaCl注射液沖洗，取一段放入甲醛固定液，用于光鏡病理切片；另一段用刀片在黏膜側切取約1 mm3組織3塊，放入2.5%中性戊二醛中固定，用于電鏡切片。另兩組腸組織采集同對照組。

1.3 檢測項目及方法

1.3.1 ELISA法測定患者血漿DAO、D-乳酸及IFABP 操作步驟按試劑說明書進行，先測定不同濃度標準品的光密度(D)值，繪制濃度—光密度標準曲線，再測定樣品光密度并根據標準曲線換算成相應的濃度。若樣品濃度超過標準曲線范圍則將樣品成倍稀釋。

1.3.2 腸黏膜病理切片制作及觀察 從固定液中取出腸組織，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片機切片，再行HE染色。光鏡下每個切片先低倍鏡后高倍鏡分別觀察，以病變最嚴重者作該組織的病理評分。

腸黏膜病理以Chiu氏評分[5]評估：5 分，固有膜結構消失并有明顯組織出血及潰瘍；4 分，固有膜和絨毛組織脫落，伴隨固有膜細胞結構模糊；3 分，腸黏膜與黏膜下層分離，絨毛呈現傾倒、部分絨毛頂端脫落；2 分，腸上皮層與固有層分離；1分，絨毛處腸黏膜上皮下間隙增大；0分，正常小腸黏膜絨毛組織形態學結構。

1.3.3 腸組織電鏡制片及觀察 從電鏡固定液中取出腸組織，漂洗后置于1% 鋨酸固定液1.5～2 h；漂洗3次，每次10 min；經30%、50%、70%、90%及100%乙醇逐級梯度脫水；純樹脂進行樹脂滲透，每級3～4 h；用包埋模具、Epon 812純樹脂包埋；在電熱鼓風干燥箱中加熱聚合固化；超薄切片機切片；雙蒸水沖洗、干燥；電鏡觀察、采集圖像。

1.4 數據處理與分析

2 結果

2.1 患者血漿DAO、D-乳酸及IFABP水平比較

ERAS組和傳統組術后1 d血漿DAO、D-乳酸及IFABP水平顯著高于術前(P均<0.01)。與傳統組相比，ERAS組術后1、3、5 d DAO水平，術后3、5 d D-乳酸水平，術后1、3 d血漿IFABP水平均明顯降低(P<0.01或0.05)。ERAS組術后1 d血漿DAO升高，至術后5 d仍高于術前(P<0.05或0.01)；術后5 d D-乳酸與術前比較無統計學差異(P>0.05)，傳統組仍明顯高于術前(P<0.05)；血漿IFABP水平，ERAS組術后3 d與術前比較無統計學意義(P>0.05)，傳統組術后3 d仍明顯高于術前(P<0.05)。見圖1。

a：P<0.05，b：P<0.01，與同組術前比較；c：P<0.05，d：P<0.01，與同時間點傳統組比較圖1 兩組患者血漿DAO、D-乳酸和IFABP水平比較

2.2 大鼠腸黏膜病理變化

由圖2可見，術后兩組大鼠腸黏膜損傷程度不同。傳統組術后24 h顯示絨毛傾倒、脫落，術后72 h絨毛部分修復，但腸黏膜上皮細胞下間隙增大；ERAS組術后24 h顯示腸系膜上皮細胞層與固有層分離，術后72 h絨毛組織結構已完整，但淋巴細胞浸潤增多。對照組的腸黏膜絨毛組織結構正常。

對照組腸黏膜病理評分為0分。ERAS組術后24 h及72 h腸黏膜病理評分均明顯低于傳統組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組大鼠回腸黏膜病理評分

2.3 大鼠腸黏膜上皮細胞超微結構變化

超微結構顯示，兩組大鼠腸上皮細胞以及緊密連接破壞程度不同。傳統組術后24 h上皮細胞壞死，微絨毛脫落；72 h微絨毛部分恢復，但微絨毛很短，緊密連接仍消失。ERAS組術后24 h上皮細胞大體結構及細胞器清晰，只微絨毛部分脫落和上皮細胞間連接線模糊；術后72 h微絨毛稍短，已可見部分緊密連接。對照組細胞間界線清晰，細胞微絨毛細長、排列整齊，緊密連接完整，細胞間連接復合體結構清晰。見圖3。

圖3 各組大鼠腸上皮細胞超微結構

3 討論

臨床上多種因素可導致腸黏膜屏障不同程度損傷，腹部大手術患者更有不同程度的腸屏障受損[6]。DAO主要存在于腸黏膜絨毛上皮細胞中，是一種胞內酶[7]，IFABP亦主要存在于腸上皮細胞，多位于細胞胞質，二者都能較好地反映腸上皮細胞損傷[8]。

在哺乳動物中，D-乳酸是腸道許多細菌的代謝產物，且在體內不能再被降解、代謝，當腸黏膜屏障受損時，D-乳酸則以最終產物進入血液，檢測其外周血水平亦可反映腸黏膜屏障受損程度[9]。有研究比較腹腔鏡與開腹胃癌手術患者術前1 d及術后第1、3、7 d的血漿DAO和L-乳酸水平，結果顯示上述各時間點二者水平均無差異，因此腹腔鏡胃切除手術亦可造成腸屏障功能損傷[10]。本研究病例均采用腹腔鏡行胃切除術，結果顯示，ERAS組和傳統組術后1 d血漿DAO、D-乳酸及IFABP水平均顯著高于術前，提示胃切除術可損害腸屏障功能。近年來，研究認為在反映腸黏膜細胞破壞的指標中，IFABP特異性和敏感性高，因其半衰期短，在血液中的峰值時間較短，是反映腸屏障功能障礙的早期指標，更具臨床應用價值[11]。本研究亦發現術后1 d血漿IFABP水平明顯增高，其后下降速度較DAO和D-乳酸快，ERAS組在術后3 d已接近正常，因此IFABP易早期檢測。

腸黏膜的組織學結構是腸屏障的結構基礎，主要包括腸上皮細胞、上皮細胞間的緊密連接、黏膜固有層等，其中上皮細胞間的緊密連接對腸屏障功能影響最大，它可以封閉細胞之間的間隙，防止腸道中的共生微生物和致病微生物的侵襲[12]。本研究ERAS組及傳統組胃切除術后腸黏膜均有不同程度損傷，表現為腸黏膜上皮細胞下間隙增大、上皮細胞層與固有層分離，嚴重者有絨毛破壞、脫落；超微結構顯示腸上皮細胞可發生變性、壞死，腸上皮細胞間緊密連接完整性受損。

ERAS的主要目的是盡快實現術后機體生理狀態和全身多器官功能包括腸道功能康復。2014年歐洲制定首個《胃切除術加速康復外科指南》[13]，該指南有關ERAS圍術期營養管理的要素亦提倡術前口服碳水化合物及術后早期腸內營養。有研究將術前口服碳水化合物大鼠與術前單純飲水大鼠作比較，前者在缺血再灌注情況下肝、腎和腸系膜淋巴結中細菌含量降低[14]；胃切除術后第1天進食有助于促進術后腸蠕動、動力恢復，且不增加術后并發癥和病死率[15]。上述研究結果表明，術前碳水化合物及術后早期腸內營養對腸功能恢復有益。本研究中ERAS組按圍術期營養管理要求，術前6 h和術前2 h口服碳水化合物，術后早期腸內營養，結果顯示ERAS組血漿DAO水平術后1、3和5 d均低于傳統組，血漿D-乳酸水平術后3 d和5 d低于傳統組，血漿IFABP水平術后1 d和3 d低于傳統組，提示ERAS圍術期營養管理有利于腸道功能快速康復。

此外，本研究顯示ERAS組術后24 h腸黏膜病理評分明顯低于傳統組，上皮細胞超微結構及緊密連接破壞程度較輕；術后72 h兩組腸黏膜超微結構均有改善，且ERAS組病理評分亦明顯低于傳統組，上皮細胞超微結構及緊密連接改善亦較明顯，說明ERAS組腸黏膜損傷恢復更快，提示ERAS圍術期營養管理有利于減輕腸黏膜病理及上皮細胞緊密連接的損傷并促進其修復。早期腸內營養能直接為腸道黏膜提供營養物質、刺激腸蠕動增加、盡快恢復腸黏膜血流、減少腸道原籍菌移位、刺激腸腺分泌，因而能減輕腸黏膜應激損傷并能促進腸黏膜增生和修復[16]。

綜上所述，ERAS圍術期營養管理能減輕腸道黏膜物理屏障損傷，有利于腸道屏障結構和功能的盡早恢復。