體外受精-胚胎移植患者黃素化起始前后激素水平差異對累積助孕結局影響的研究

張多多，甄璟然，王含必，郁琦，鄧成艷

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院婦科內分泌與生殖中心，北京 100730)

性激素水平對IVF/ICSI的促排卵治療有重要的監測和指導作用，在促排卵的不同階段往往會關注不同性激素的變化，目前已經對于促排卵期間卵泡期的不同性激素增減趨勢有了較為充分的認識[1-2]，但是關于促排卵在扳機后的黃素化改變研究較少。經典的卵巢周期性激素理論認為在排卵前12 h左右孕酮、雄烯二酮和雌二醇的水平都在增長，但排卵后孕酮水平繼續升高而雄烯二酮和雌二醇水平出現短暫下降[3-4]。而實際促排卵過程有別于自然周期，我們觀察到在扳機后一天患者的雌二醇水平增減表現不一，孕酮雖然整體呈增長趨勢，但增幅也不近相同[5]。為了進一步明確這一問題，我們設計了如下研究，旨在探索促排卵患者在基礎狀態及扳機前后血清促性腺激素與性激素水平的增減變化和變化幅度是否與助孕結局存在關系。

資料和方法

一、研究對象

本研究回顧性納入了北京協和醫院2014年7月1日至2018年3年31日期間的IVF/ICSI 取卵周期，促排卵均使用GnRH激動劑卵泡期長方案，共4 176周期。研究倫理編號S-K601。

研究僅納入盆腔-輸卵管因素或男方因素不孕的患者，排除了GnRH激動劑扳機的周期、胚胎未使用完的周期、贈卵周期，以及無法隨訪到產科結局的患者。

二、治療過程

進入IVF治療流程后于月經周期第2天抽血查基礎性激素水平，該時刻激素水平稱為基礎值(T0時刻)。降調節后20 d左右，滿足血清FSH<5 U/L、E2<183.5 pmol/L，無大于10 mm的卵泡時，開始使用重組人FSH(rFSH，果納芬，默克雪蘭諾，瑞士)啟動，正常反應人群啟動劑量為每日rFSH 150～225 IU，根據患者的年齡、BMI以及卵巢儲備情況個體化增減。促排卵過程中，依據患者的卵巢反應性，rFSH劑量可以增減或更換為HMG(賀美奇，輝凌，德國)。當出現至少3個卵泡直徑≥17 mm時，注射 250 μg重組HCG(rHCG，艾澤，默克雪蘭諾，瑞士)扳機，扳機當天清晨抽血查性激素六項(T1時刻)，扳機后第一日清晨(約扳機后12 h，T2時刻)再次抽血查性激素六項，扳機后36 h左右取卵。

IVF/ICSI授精后16～18 h評估2個原核的出現情況，之后每日觀察胚胎發育的情況直至第3天卵裂期胚胎(D3胚胎)移植。依據文獻報道方法為所有正常受精的胚胎評分[6-7]。在取卵后第3天，得分最高的胚胎進行新鮮移植，剩余的胚胎進行囊胚培養并玻璃化冷凍保存。

凍融胚胎移植(FET)采用人工周期或自然周期內膜準備，于添加孕激素起的第4天或排卵后的第3天移植D3卵裂期胚胎；或添加孕激素起的第6天或排卵后的第5天移植囊胚。黃體支持方案為以陰道內黃體酮緩釋凝膠(雪諾同，默克雪蘭諾，瑞士)90 mg qd為基礎，可聯用口服地屈孕酮片(達芙通，雅培，荷蘭)10～20 mg qd，直至孕10周左右逐漸停藥。

三、性激素檢測指標

血清FSH、LH、E2、孕酮(P)和睪酮(T)水平使用自動化 Elecsys化學發光法(Beckman，美國)。檢測體系內部的變異程度分別為：E2<5%，P和T均<10%，FSH和LH均<8%。先對比五種性激素在T0、T1和T2時刻的絕對數值及其變化，又進一步對比了T2相對于T1時刻的上述五種性激素變化幅度。

四、結局指標

本研究的結局觀測指標為累積臨床妊娠率(cumulative clinical pregnancy rate)和累積活產率(cumulative live birth rate)。“累積”是指一次IVF促排取卵周期獲得所有胚胎移植后的累積結局，包括新鮮周期和解凍移植周期。臨床妊娠是指超聲下觀測到胎心搏動；活產是指大于28周的活產。

五、統計學分析

本研究的數據統計由SPSS 24.0 軟件完成。通過Kolmogorov-Smirnov 檢驗(P=0.01)來評估連續性資料的正態性。連續正態分布資料使用(均數±標準差)來描述分布，非正態連續變量使用中位數(四分位數)M[P25，P75]來描述分布。兩組獨立的連續性變量使用t檢驗或者Mann-WhitneyU檢驗來比較。重復測量資料采用雙因素重復測量的方差分析進行統計。所有的統計量均使用雙尾檢驗，定義有統計意義為P<0.05。

結 果

一、促排卵不同時間點性激素水平與妊娠結局關系

最終符合條件的3 009個IVF/ICSI周期納入分析。其中，2 098個IVF周期，911個ICSI周期。

按照妊娠結局(有或無累積妊娠、有或無累積活產)分組：有累積妊娠者1 585人，無累積妊娠者1 424人；有累積活產者1 381人，無累積活產者1 628人。我們分別對照了不同妊娠結局人群的FSH、LH、E2及T四種性激素在T0、T1及T2時刻的變化水平(表1～5)。

對于妊娠結局較好(有累積妊娠或累積活產者)的一組，各檢測時間點FSH水平均更低(P<0.001)(表1)；妊娠結局較好組LH基礎值水平稍高(P<0.05)，之后均顯著低于妊娠結局較差組(無累積妊娠或無累積活產者)(P<0.001)(表2)。不同妊娠結局組E2基礎值無顯著差異(P>0.05)，之后兩個檢測時間點妊娠結局較好組E2水平更高(P<0.001)(表3)。妊娠結局較好組在任何檢測時間點均有更高的T水平(P<0.001)(表4)。由于本院患者缺少基礎狀態P水平數據，只對比了T1及T2時刻，妊娠結局較好組扳機后(T2時刻)的P水平更高(P<0.001)(表5)。

表1 不同妊娠結局組3個時間點FSH水平比較[U/L，M(P25，P75)]

表2 不同妊娠結局組3個時間點LH水平比較[U/L，M(P25，P75)]

表3 不同妊娠結局組3個時間點E2水平比較[pmol/L，M(P25，P75)]

表4 不同妊娠結局組3個時間點T水平比較[nmol/L，M(P25，P75)]

表5 不同妊娠結局組兩個時間點P水平比較[nmol/L，M(P25，P75)]

二、性激素增幅差異與累積妊娠結局的關系

為進一步對比在扳機日(T1)和扳機后一天(T2)性激素的改變情況，我們將T2與T1激素水平的差值(△T=T2-T1)在有或無累積妊娠以及有或無累積活產這兩個結局之間的差異進行對比。扳機后一天相比扳機日對比(△T)，不同妊娠結局患者間FSH的變化均無統計學差異(P>0.05)；有累積活產的患者相比無累積活產的患者LH下降更加明顯(P<0.05)；在兩種妊娠結局中，有累積妊娠或活產者E2、P和T的增量均顯著更高(P<0.001)(表6)。

表6 不同妊娠結局組扳機后一天(T2)與扳機日(T1)激素水平變化比較[-(sd)]

討 論

我們的研究觀察到對于妊娠結局較好(有累積妊娠/累積活產)的人群相比于妊娠結局較差(無累積妊娠/累積活產)的人群在扳機日扳機后一天，FSH和LH的水平均較低，而雌二醇、孕酮和總睪酮水平顯著較高。對比各項激素水平在這兩天增量的絕對值，妊娠結局較好的一組雌二醇、孕酮和總睪酮在扳機后一天相比于扳機日的絕對增幅均顯著大于妊娠結局較差的一組，而有累積活產的人群LH的下降幅度稍明顯，FSH的變化未見明顯的差異。

經過GnRH激動劑長方案降調節后，血FSH的濃度基本反映了患者接受rFSH注射的量。如果將獲卵數分為<5枚、5～15枚和>15枚，可以發現三個組每個卵平均接受的rFSH暴露量分別為484 IU、218 IU和89 IU[8]，也就是rFSH暴露劑量越小，獲卵數就越多。另外已有研究證實，大劑量的FSH暴露會削弱胚胎的種植潛力[9]。這與我們妊娠結局較好的一組人群中在扳機日和扳機之后一天FSH都較結局較差一組更低是一致的。而相同量的LH作用下，LH受體表達量越大，顆粒細胞對LH的敏感性越強[10]。我們認為妊娠結局較好的一組患者中顆粒細胞對LH有更好的敏感性，所以LH水平低于結局較差組，而扳機后LH下降的也更快，妊娠結局較好組的孕酮水平和增量都更高，也反映了卵泡內細胞的LH敏感性更好。

有學者對促排卵多卵泡發育狀態下猴的圍排卵期甾體代謝途徑進行了探索，發現在HCG扳機后的12 h內低密度脂蛋白(LDL)受體mRNA表達一過性升高，而在24～36 h降至基礎水平，提示扳機時觸發了一過性的甾體合成底物膽固醇的旺盛需求；甾體代謝的限速酶側鏈裂解酶(P450scc)的mRNA表達在0～24 h內下降，之后在36 h逐漸上升至原水平；而3β類固醇脫氫酶(3β-HSD)的mRNA濃度在HCG扳機后12 h內增加了17倍，提示黃素化后雌激素開始由Δ5途徑合成向Δ4、Δ5途徑共同合成發生轉化；而芳香化酶的活性始終保持穩定[11]。我們推測妊娠結局好的一組患者可能在底物水平有更豐富的膽固醇進入甾體代謝或限速酶P450scc有更高的活性或濃度，所以在扳機后第一天約12 h查血清雌二醇水平會更高；或者這種更高的水平的甾體代謝也可能原因是更多的卵泡發育時 的累積作用，造成更多的雌激素的分泌。而睪酮是Δ5途徑的代謝產物脫氫表雄酮經3β脫氫酶催化而成的雌二醇的前體物質，所以在妊娠結局較好的一組患者中雌二醇與睪酮的絕對值及增量都更大[11-12]。同樣也有研究觀察到，在自然周期中如果在臨近排卵前出現雌二醇水平的增長平臺或略降低(10%以內)，可能與即將發生提早排卵或卵子質量差相關[13]，這從反面論證了我們觀察到雌二醇增量大的患者助孕結局更佳。對15 000個初次取卵周期的觀察得出累積活產率隨獲卵數增加而逐漸升高，在獲得≥25顆卵時達到70%，超過27枚卵之后累積活產率又繼續增加了5.1%[14]。可見獲卵數越多，累積活產率就越大。因為雌二醇的水平及扳機后孕酮升高的水平與成熟卵泡的數量相關，所以雌孕激素水平都與累積妊娠率與累積活產率相關。

在我們的患者中，妊娠結局較好的一組，不論在扳機日還是扳機后一天都有更高的孕酮水平，這與晚卵泡期孕酮水平升高造成對妊娠結局的負面影響并不矛盾。首先我們兩組患者的孕酮均值均小于孕酮對妊娠結局產生不良影響的界值1.5 ng/ml(4.77 nmol/L)[15]；另外，我們納入的是一般人群，既往研究觀察到在低反應患者中晚卵泡期孕酮水平的升高會顯著的影響繼續妊娠率，而在正常反應人群中卻未見這種影響[16]。我們發現在扳機后一天孕酮較扳機日的增量在有累積妊娠/累積活產組中更高，這與另一項研究的觀察具有一致性，該研究觀察到在使用HCG扳機的人群中，取卵日相比于扳機日，獲卵越多的患者孕酮增量越大，作者認為這與這些患者顆粒細胞有更好的LH敏感性相關，黃素化反應更加充分[8]。

本研究的局限性在于所有的數據均來自于卵巢功能相對正常的不孕人群，及輸卵管因素和男方因素，不涉及排卵障礙及子宮內膜異位癥等卵巢功能異常的患者。所以本研究的結果能否用于其他不孕人群尚待進一步探索。此外，本研究雖然涉及了基礎狀態、扳機及扳機后一天3個特殊時間點，但扳機后一天并不能完全代表黃素化之后的完整情況，只能說明早期黃素化的早期狀態。

綜上，我們的研究系統且全面的對比了在GnRH激動劑長方案促排卵的多卵泡發育狀態下，常見性激素水平及其增長趨勢與累積妊娠結局存在密切關系。扳機及扳機后一天更高的甾體性激素水平提示更好的輔助生殖結局。