多囊卵巢綜合征患者HMGA2基因多態性與胰島素抵抗的相關性研究

王景娜，魏蕊霞，賈君

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第980醫院婦產科，石家莊 050000)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期女性最常見的生殖內分泌疾病，以高雄激素血癥、卵巢多囊樣改變和稀發/無排卵為主要特征，常合并胰島素抵抗(IR)，導致一系列代謝異常，這與2型糖尿病的臨床表現相似。全基因組關聯分析研究(Genome-wide association study，GWAS)表明高遷移率族蛋白A2(high mobility group A2，HMGA2)為PCOS和2型糖尿病的共同易感基因[1-2]。HMGA2是一種非組蛋白染色體蛋白，本身并無轉錄活性，但可通過改變染色體結構來調節其他基因的轉錄[3]。研究表明，HMGA2可能參與調控卵巢高級別漿液性癌腫瘤細胞凋亡，且可能與卵巢上皮細胞癌的順鉑耐藥性有關[4-5]。Jiao等[6]研究顯示HMGA2基因的rs2272046位點的多態性與PCOS有關。目前未見有關于HMGA2基因rs2272046位點多態性與PCOS患者IR相關性的研究。本研究對河北PCOS人群HMGA2基因多態性進行分析，探討HMGA2多態性與PCOS臨床IR和發病風險之間的關系，為IR的發病機制提供研究思路。

資料與方法

一、研究對象

選取2019年5月至2020年1月于本院就診的98例PCOS患者為研究對象。

98例PCOS患者(PCOS組)根據空腹胰島素水平是否升高或耐糖量是否下降再分為胰島素抵抗組(IR組，54例)和非胰島素抵抗組(NIR組，44例)兩個亞組。IR診斷標準[7]：(1)空腹胰島素水平>15 mU/L；(2)根據1999年WHO診斷標準[8]診斷為糖耐量下降。符合該兩個條件之一即診斷為IR。

納入標準：PCOS診斷符合2003年鹿特丹診斷標準[9]；未伴有其它惡性腫瘤者；臨床資料保存完整者；漢族人群。

排除標準：陰道超聲檢查，子宮及卵巢發現有器質性病變者；近3個月服用過激素類藥物者；伴有內分泌、高血壓等疾病者；有糖尿病家族史。

另選取同期例因單純輸卵管因素或男性因素不孕在本院生殖中心門診就診的86例非PCOS不孕婦女作為對照(對照組)。

本研究中所有患者均由主治醫師明確診斷。本試驗經醫院臨床研究倫理委員會批準，所有受試對象對本研究均知情并簽署知情同意書。

二、主要試劑與儀器

核酸提取試劑盒和核酸自動提取儀(廈門致善生物)；SYBRPremixExTaqTMII Kit(大連寶生物)；熒光定量PCR儀(QIAGEN，德國)；PUZS-300自動生化分析儀(上海帝博思生物科技)；Beckman Dxi800型全自動免疫化學發光分析儀(Beckman，美國)。

三、研究方法

1.樣品采集及保存：抽取所有受試者清晨空腹外周靜脈血(PCOS組月經規律者在月經周期的第3～5天，月經不規律者在B超檢查未見優勢卵泡時)，3 000 r/min離心15 min后收集血清，迅速置于-80℃保存待測，用于血清學相關指標測定。

2.血清學相關指標測定：采用全自動生化分析儀測定血糖水平，化學發光法檢測血清LH、FSH、睪酮(T)、胰島素。穩態模型IR指數(HOMA-IR)=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。

3.HMGA2基因rs2272046位點SNP檢測：抽取受試者2 ml外周靜脈血，EDTA抗凝。采用核酸提取試劑盒提取外周血基因組DNA。PCR引物由Primer 5.0軟件設計，上海生工生物工程公司合成。上游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTGCAC-3′；下游引物：5′-TATCTGTGCGTGTGACAGCGGCT-3′。熒光PCR反應體系共20 μl：SYBRPremixExTaqTMII 10 μl，上下游引物各0.5 μl(10 μmol/L)，DNA 模板1.0 μl，ddH2O 8.0 μl。PCR程序為：95℃ 預變性 5 min；95℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，40個循環；72℃終末延伸5 min。PCR產物經溶解曲線或瓊脂糖電泳驗證，溶解曲線為整齊單一的特異峰或電泳條帶為單一條帶且條帶長度符合，說明擴增成功。PCR產物純化后送上海生工生物工程公司測序，BLAST進行測序結果比對，判讀基因型。

四、統計學分析

結 果

一、患者一般資料及生殖激素水平比較

PCOS組與對照組間年齡、血清FSH水平差異無統計學意義(P>0.05)；PCOS組體質量指數(BMI)、腰臀比(WHR)、血清LH、T水平均顯著高于對照組(P<0.05)(表1)。

表1 患者一般資料及生殖激素水平比較(-±s)

二、Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

HMGA2在rs2272046位點上有3種基因型，分別為CC型、CA型、AA型。根據Hardy-Weinberg平衡定律，對照組、PCOS組以及IR和NIR亞組HMGA2在rs2272046位點上的各基因型的期望值和觀測值符合Hardy-Weinberg平衡定律(P均>0.05)，提示群體來自同一孟德爾群體，所選樣本進行群體遺傳學研究具有代表性(表2)。

三、各組患者HMGA2基因rs2272046位點基因型和基因頻率分布

對照組基因型中CC型(55.81%)最多，其次為CA型(37.21%)，AA型(6.98%)最少；PCOS組中CA、AA兩種基因型占比較對照組顯著升高(P<0.05)，且IR組中CA、AA兩種基因型占比較NIR組顯著升高(P<0.05)。IR組中的A等位基因頻率顯著高于NIR組，而C等位基因頻率顯著低于NIR組(P<0.05)(表3)。

表2 Hardy-Weinberg平衡檢驗

表3 各組患者HMGA2基因rs2272046位點基因型和基因頻率分布[n(%)]

四、IR組患者HMGA2基因rs2272046位點不同基因型與血糖、胰島素等的關系

IR組患者CA型和AA型基因型空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR水平均顯著高于CC型患者(P<0.05)(表4)。

五、影響IR發生的多因素分析

將PCOS患者是否發生IR作為因變量，校正年齡、BMI、WHR、FSH、LH、T、空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR等混雜因素后，以HMGA2基因rs2272046位點的三種基因型(CC型、CA型、AA型)為自變量進行Logistic回歸分析，結果顯示AA型基因型是影響IR發生的獨立危險因素(P<0.05)(表5)。

表4 IR組患者HMGA2基因rs2272046位點不同基因型與血糖、胰島素等的關系(-±s)

表5 影響IR發生的多因素分析

討 論

PCOS是一種復雜的、異質性較高的多基因疾病，其發生受基因與環境共同作用的影響，其中IR是PCOS重要的病理生理變化之一，大約60%～70%的PCOS患者發生胰島素抵抗[10]，因此參與胰島素代謝的基因在PCOS患者IR的發生發展中具有重要作用。而臨床中PCOS的IR增加了高血壓、脂質代謝異常等的發生風險[11]，因此研究胰島素代謝相關基因，可能對疾病的預防有重要作用。

GWAS研究表明HGMA為PCOS的易感基因，HMGA2基因定位于12q14.3，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAEG)中有較強的遷移能力而得名。其編碼的蛋白可作為構筑轉錄因子，可結合并改變染色質構象從而調節其他基因的轉錄；參與多個生物學過程的調控，在胚胎發生中高度表達，在大多數成熟和分化組織中幾乎不表達[12-13]，通過促進細胞的增殖與遷移從而介導腫瘤的發生。HMGA2的過度表達可誘導卵巢上皮細胞發生惡化性轉化，與卵巢癌的發生、發展密切相關，有文獻報道HMGA2能促進PCOS患者的卵巢顆粒細胞增殖[14]。目前關于其基因多態性在PCOS中的研究報道較少[15-16]。

本研究結果顯示，PCOS組的IR組患者中的A等位基因頻率明顯高于NIR患者，提示rs2272046 C/A位點多態性可能與PCOS患者發生IR有關。本研究進一步發現，發生IR的CA型及AA型基因型PCOS患者具有較高的空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR水平，進一步提示患者體內HMGA2基因rs2272046位點基因型表達異常可能影響患者體內血糖和胰島素調節機制，而此調節機制的改變可能成為PCOS患者發生IR的主要因素，與陳曦[17]的結論基本一致。本研究的二元Logistic回歸分析顯示基因型AA型是影響IR發生的獨立危險因素，進一步提示攜帶AA型基因型的PCOS患者可能更傾向于發生IR，推測HMGA2基因的rs2272046 A可能是PCOS患者罹患IR的易感等位基因。

本研究結果還發現，PCOS患者具有較高的BMI、WHR及LH等激素水平。朱文靜等[18]研究結果顯示，PCOS患者的BMI、WHR、LH及睪酮等水平均高于對照組，與本研究結果基本一致，提示部分肥胖患者可能導致PCOS的發生，進而出現血脂水平異常，推測血脂水平進一步影響患者體內激素水平，導致這些疾病之間相互關聯、互相促進[19]

綜上所述，HMGA2單核苷酸多態性與PCOS患者IR有一定相關性，其中CA型、AA型基因型可能與IR發生有關。該研究從基因層面探討PCOS的發病機制，為今后PCOS的IR診療提供了新思路，但本研究存在一定的局限性：本研究為單個中心的臨床試驗，此結果僅能解釋本地區HMGA2基因rs2272046位點單核苷酸多態性與PCOS患者IR存在一定相關性。因此，將來需大規模、多中心的臨床研究來進一步證實及闡述HMGA2單核苷酸多態性在PCOS發病中的作用機制。