非優(yōu)質(zhì)D3剩余卵裂胚所形成囊胚的FET周期妊娠結(jié)局分析

李澎濤，王娜，郭戰(zhàn)坤，殷晨星，孟娜娜，師楠，于曉光，李克用，王玉真

(保定市婦幼保健院生殖中心，保定 071000)

隨著囊胚培養(yǎng)技術(shù)及玻璃化冷凍技術(shù)的發(fā)展，囊胚移植得以實(shí)現(xiàn)并廣泛應(yīng)用于臨床。在囊胚培養(yǎng)的過(guò)程中發(fā)育潛能差或染色體異常的胚胎被淘汰，而且囊胚與子宮內(nèi)膜發(fā)育階段同步，因此囊胚移植具有更高的臨床妊娠率、著床率，為單囊胚移植成為現(xiàn)實(shí)打下了基礎(chǔ)，而單囊胚移植可顯著降低多胎率，以緩解因多胎造成的各種風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。影響囊胚形成及囊胚發(fā)育潛能的因素眾多，例如患者年齡、原核期胚胎質(zhì)量、卵裂期胚胎質(zhì)量、培養(yǎng)環(huán)境等[3-5]，本研究探討非優(yōu)質(zhì)D3剩余卵裂胚質(zhì)量對(duì)繼續(xù)囊胚培養(yǎng)的囊胚形成及其所形成囊胚發(fā)育潛能的影響，從而為臨床選擇更具有發(fā)育潛能的胚胎提供參考。

一、資料與方法

1.研究對(duì)象：2017年2月至2019年10月在保定市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科接受IVF-ET治療后非優(yōu)質(zhì)D3卵裂胚繼續(xù)囊胚培養(yǎng)所形成囊胚的單囊胚FET周期及同期優(yōu)質(zhì)D3卵裂胚FET周期的患者。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)IVF-ET周期患者采用常規(guī)長(zhǎng)方案控制性促排卵；(2)女方年齡24～34歲；(3)女方體重指數(shù)(BMI)18～25 kg/m2；(4)雙方均無(wú)遺傳性疾病；(5)復(fù)蘇周期采用人工周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案；(6)優(yōu)質(zhì)D3卵裂胚FET周期或非優(yōu)質(zhì)D3剩余卵裂胚繼續(xù)囊胚培養(yǎng)所形成囊胚的單囊胚FET周期。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)血抗苗勒管激素(AMH)≤1.1 ng/ml、竇卵泡數(shù)(AFC)<6的卵巢功能減退患者；(2)子宮內(nèi)膜異位癥患者。

2.非優(yōu)質(zhì)D3剩余卵裂胚繼續(xù)培養(yǎng)/冷凍及FET周期：納入本研究的所有FET周期患者IVF-ET周期均采用常規(guī)長(zhǎng)方案控制性促排卵，于HCG注射36 h后經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下取卵。利用G-seriesTM培養(yǎng)液培養(yǎng)胚胎至D3，依據(jù)ASEBIR卵裂期胚胎評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[6]對(duì)胚胎進(jìn)行評(píng)價(jià)，根據(jù)細(xì)胞數(shù)、碎片率、均一度、多核/空泡表現(xiàn)及透明帶狀況等，將D3卵裂胚分為I～I(xiàn)V級(jí)，評(píng)級(jí)為Ⅰ級(jí)為優(yōu)質(zhì)卵裂胚；移植或冷凍后剩余非優(yōu)質(zhì)D3卵裂胚繼續(xù)囊胚培養(yǎng)至D5/D6，依據(jù)Gardner囊胚分級(jí)法[7]對(duì)形成的囊胚進(jìn)行評(píng)價(jià)，選擇3期及以上且滋養(yǎng)層或內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)級(jí)不同時(shí)為C的囊胚冷凍保存。

卵裂胚及囊胚的冷凍和解凍均使用日本Kitazato公司的冷凍及解凍套裝。囊胚冷凍前均進(jìn)行激光打孔皺縮。按照試劑說(shuō)明書對(duì)胚胎進(jìn)行冷凍及復(fù)蘇，復(fù)蘇后對(duì)卵裂胚透明帶進(jìn)行削薄、3/4期囊胚進(jìn)行激光輔助孵化。

胚胎復(fù)蘇后，在37℃、6%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2 h后觀察并記錄解凍胚胎細(xì)胞的存活細(xì)胞數(shù)、壞死細(xì)胞數(shù)及繼續(xù)培養(yǎng)后的生長(zhǎng)情況。復(fù)蘇后3～4 h，用移植管連接BD1 ml氣密注射器，一段式裝管后，B超引導(dǎo)下將胚胎移植入子宮腔中后部。解凍D3優(yōu)質(zhì)卵裂胚移植1～2枚，囊胚擇優(yōu)行單囊胚移植。胚胎移植后35 d腹部B超觀察到宮腔內(nèi)孕囊及心管搏動(dòng)為臨床妊娠。

3.研究分組：依據(jù)繼續(xù)囊胚培養(yǎng)的非優(yōu)質(zhì)D3剩余卵裂胚質(zhì)量分為A組(Ⅱ級(jí)D3剩余卵裂胚組)、B組(Ⅲ級(jí)D3剩余卵裂胚組)、C組(Ⅳ級(jí)D3剩余卵裂胚組)，所形成的囊胚FET周期依次為A1、B1、C1組。另以優(yōu)質(zhì)D3卵裂胚(I級(jí))FET周期為移植結(jié)局對(duì)照組(D組)。

4.觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)：囊胚形成率=D5/D6形成的2期以上囊胚數(shù)/繼續(xù)培養(yǎng)胚胎數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)囊胚形成率=D5/D6形成的優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)/繼續(xù)培養(yǎng)胚胎數(shù)×100%；可利用囊胚形成率=D5/D6形成的可利用囊胚數(shù)/繼續(xù)培養(yǎng)胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=超聲下能檢測(cè)到孕囊的妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；著床率=超聲下檢測(cè)到的孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；早期流產(chǎn)率=孕周<12周的流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

二、結(jié)果

1.D3剩余胚胎繼續(xù)囊胚培養(yǎng)結(jié)局：繼續(xù)培養(yǎng)的非優(yōu)質(zhì)D3剩余卵裂胚共3 015枚，其中Ⅱ級(jí)D3剩余卵裂胚515枚、Ⅲ級(jí)D3剩余卵裂胚1 664枚、Ⅳ級(jí)D3剩余卵裂胚836枚；共形成囊胚1 317枚，其中可利用囊胚963枚、優(yōu)質(zhì)囊胚474枚。

隨著D3剩余卵裂胚質(zhì)量下降，繼續(xù)囊胚培養(yǎng)卵裂胚的囊胚形成率、D5/D6可利用囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率均顯著下降(P<0.01)(表1)。

表1 D3剩余胚胎繼續(xù)囊胚培養(yǎng)結(jié)局比較[n(%)]

2.FET周期臨床結(jié)局：本研究比較了不同質(zhì)量的非優(yōu)質(zhì)D3剩余卵裂胚繼續(xù)囊胚培養(yǎng)所形成囊胚的單囊胚FET結(jié)局，共264個(gè)單囊胚FET周期，其中A1組116周期、B1組82周期、C1組66周期。并且與同期D3優(yōu)質(zhì)卵裂胚FET的79周期(D組)進(jìn)行比較。

患者基本情況：各組間患者年齡、不孕年限、BMI、既往周期數(shù)、基礎(chǔ)FSH值和移植日子宮內(nèi)膜厚度等比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表2 FET周期各組患者基本情況比較(-±s)

臨床結(jié)局：C1組移植D5囊胚比例顯著低于A1、B1組(P<0.05)，臨床妊娠率亦顯著低于A1、B1組(P<0.05)；A1、B1組著床率顯著高于C1、D組(P<0.05)；C1組活產(chǎn)率顯著低于A1組(P<0.05)。早期流產(chǎn)率、異位妊娠率各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

表3 FET周期各組患者妊娠結(jié)局的比較(%)

三、討論

囊胚培養(yǎng)越過(guò)了胚胎基因組激活階段，一些發(fā)育潛能差及染色體異常的胚胎在囊胚培養(yǎng)過(guò)程中被淘汰，從而提高了移植周期臨床妊娠率及胚胎著床率[7]，并且囊胚比卵裂期胚胎冷凍效果更好[8]。隨著囊胚培養(yǎng)及玻璃化冷凍技術(shù)在輔助生殖領(lǐng)域的發(fā)展，囊胚冷凍、囊胚移植在很多生殖中心得到廣泛應(yīng)用。盡管囊胚移植具有以上眾多優(yōu)勢(shì)，但影響囊胚形成及其移植結(jié)局的因素眾多，本文主要就非優(yōu)質(zhì)D3剩余卵裂胚質(zhì)量對(duì)繼續(xù)囊胚培養(yǎng)卵裂胚的囊胚形成及其所形成囊胚發(fā)育潛能的影響進(jìn)行了探討分析。

章志琴等[3]對(duì)D3剩余胚胎囊胚培養(yǎng)，采用Logistic逐步回歸法對(duì)影響優(yōu)質(zhì)囊胚形成率的相關(guān)因素進(jìn)行了分析，該研究認(rèn)為D2卵裂球數(shù)4個(gè)的胚胎繼續(xù)囊胚培養(yǎng)的優(yōu)質(zhì)囊胚形成率顯著高于少于卵裂球數(shù)4個(gè)的胚胎，隨著D3卵裂球數(shù)的增多，優(yōu)質(zhì)囊胚形成率也隨之升高，但8個(gè)卵裂球的胚胎的優(yōu)質(zhì)囊胚形成率優(yōu)于9～10個(gè)卵裂球的胚胎；胚胎碎片、空泡及多核對(duì)優(yōu)質(zhì)囊胚的形成有負(fù)面影響。Kong等[9]利用Time-Lapse研究了細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞破碎、卵裂方式與胚胎發(fā)育潛能之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞破碎的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致D3細(xì)胞數(shù)數(shù)目減少，但在≥7細(xì)胞的胚胎中細(xì)胞碎片的發(fā)生率明顯減少，囊胚形成率及優(yōu)質(zhì)囊胚形成率隨著細(xì)胞數(shù)的增加而增加，但7～8細(xì)胞時(shí)囊胚形成率及優(yōu)質(zhì)囊胚形成率是所有分組中最高的；胚胎卵裂方式亦是影響胚胎發(fā)育潛能的一個(gè)重要因素，那些非平衡性卵裂即一個(gè)卵裂球直接分裂成3個(gè)或者更多細(xì)胞的胚胎，當(dāng)卵裂細(xì)胞數(shù)≥5細(xì)胞時(shí)，胚胎發(fā)育潛能明顯降低。在細(xì)胞數(shù)5～6細(xì)胞時(shí)，相較于細(xì)胞碎片非平衡性卵裂對(duì)囊胚的形成影響更大，但在7～8細(xì)胞大多表現(xiàn)正常卵裂，雖然非平衡性卵裂也降低了胚胎發(fā)育潛能，但它們之間的比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。胚胎的發(fā)育與胚胎的非整倍體率密切相關(guān)，胚胎的非整倍體率影響胚胎發(fā)育速度、內(nèi)細(xì)胞及滋養(yǎng)層形態(tài)[10]，施文浩等[11]對(duì)D3卵裂期胚胎進(jìn)行PGS分析發(fā)現(xiàn)，卵裂期胚胎評(píng)價(jià)參數(shù)中胚胎的碎片體積比例低的胚胎整倍體率較高。本研究依據(jù)ASEBIR卵裂期胚胎評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)綜合了D3卵裂胚細(xì)胞數(shù)、碎片率、均一度、多核/空泡表現(xiàn)及透明帶狀況等對(duì)胚胎評(píng)級(jí)，不同質(zhì)量非優(yōu)質(zhì)D3卵裂胚繼續(xù)囊胚培養(yǎng)，得出與以上等研究相似的結(jié)果，即隨著D3剩余卵裂胚質(zhì)量的降低，繼續(xù)囊胚培養(yǎng)的囊胚形成率、D5/6可利用囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率亦顯著下降。

那么這些非優(yōu)質(zhì)D3剩余卵裂胚形成的囊胚發(fā)育潛能如何呢？Urman等[12]認(rèn)為D3胚胎質(zhì)量雖然影響囊胚形成率，但對(duì)所形成的囊胚質(zhì)量及其發(fā)育潛能沒(méi)有關(guān)系。但Kong等[9]的研究發(fā)現(xiàn)≥7細(xì)胞的卵裂期胚胎，整倍體率高，發(fā)育速度較之細(xì)胞數(shù)<7的胚胎要快一些，D5形成的囊胚比例高于后者，而移植D5囊胚的臨床結(jié)局明顯優(yōu)于D6囊胚[13-14]，這與本研究中FET周期由于Ⅱ/Ⅲ級(jí)D3剩余卵裂胚形成的D5囊胚移植比例高于Ⅳ級(jí)D3剩余卵裂胚形成的D5囊胚移植比例，導(dǎo)致前者的妊娠結(jié)局優(yōu)于后者的情況相符。在郭映純等[15]的研究中認(rèn)為非優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎即使形成囊胚移植后的妊娠結(jié)局并不樂(lè)觀，而在本研究中Ⅲ級(jí)D3剩余卵裂胚所形成囊胚的單囊胚FET仍能獲得較好的妊娠結(jié)局，分析其原因是由于兩個(gè)研究所采用的卵裂期評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)不一樣，本研究評(píng)分結(jié)合了D2和D3胚胎卵裂球數(shù)的發(fā)育速度均衡性，導(dǎo)致整體胚胎評(píng)分較低，Ⅲ/Ⅳ級(jí)胚胎比例偏高，造成了兩份研究結(jié)論的偏差。

在本研究中Ⅳ級(jí)D3剩余卵裂胚形成囊胚的單囊胚FET活產(chǎn)率顯著低于Ⅱ級(jí)D3剩余卵裂胚形成的囊胚，分析其原因可能是即使胚胎發(fā)育至囊胚仍有36%非整倍體率發(fā)生，低質(zhì)量卵裂期胚胎所形成囊胚的非整倍體發(fā)生率高于高質(zhì)量卵裂期胚胎所形成的囊胚[16]，導(dǎo)致即使形成了囊胚，其發(fā)育潛能亦會(huì)較差。

本研究中Ⅱ/Ⅲ級(jí)D3剩余卵裂胚所形成囊胚的單囊胚FET著床率顯著高于優(yōu)質(zhì)D3卵裂胚FET著床率，此結(jié)果與鄒敏等[17]的研究一致，其研究認(rèn)為D3剩余卵裂胚繼續(xù)囊胚培養(yǎng)至D5形成的囊胚FET周期臨床妊娠率、著床率顯著高于優(yōu)質(zhì)D3卵裂胚及D6形成的囊胚FET周期的臨床妊娠率、著床率，而優(yōu)質(zhì)D3卵裂胚與D6形成的囊胚的FET周期妊娠率、著床率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

綜上所述，剩余D3卵裂胚質(zhì)量對(duì)囊胚的形成及其發(fā)育潛能有著一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，在以往的大多文章中就影響囊胚形成的獨(dú)立因素如年齡、卵裂球數(shù)量、碎片比例、均一程度等分別進(jìn)行了研究，本研究將患者年齡限制在24～34歲，排除了年齡因素的干擾，同時(shí)將卵裂球數(shù)量、碎片比例等因素綜合起來(lái)評(píng)價(jià)卵裂期胚胎質(zhì)量，從而分析D3剩余卵裂胚質(zhì)量對(duì)卵裂胚的囊胚形成及其所形成囊胚發(fā)育潛能的影響，選擇出更具有發(fā)育潛能的囊胚。與優(yōu)質(zhì)D3卵裂胚FET周期相比，Ⅱ/Ⅲ級(jí)D3剩余卵裂胚所形成囊胚的單囊胚FET能夠獲得更高的著床率，即使Ⅳ級(jí)D3剩余卵裂胚所形成囊胚的單囊胚FET也能獲得與優(yōu)質(zhì)D3卵裂胚FET相近的妊娠結(jié)局，因此優(yōu)先選擇移植評(píng)分高的D3剩余卵裂胚形成的囊胚移植，可以提高胚胎移植效率，同時(shí)減少了促排卵等相關(guān)操作，極大降低了對(duì)患者身心健康損害及患者醫(yī)療費(fèi)用。