魚類細菌性病原分離鑒定新方法

目前魚類主要微生物病原包括細菌、真菌及病毒等，其通用的分離鑒定方法主要是培養法，即選擇合適的培養基對目標生物進行培養、純化，繼而開展相關鑒定工作，其最重要的關鍵點即培養微生物。病原微生物分離純化技術的發展給魚類病原微生物鑒定帶來極大便利，推動了魚類病原學的革命性發展。隨著研究的深入及新技術的發展，我們認識到并非所有病原微生物均可培養。而隨著養殖環境的惡化，魚類病原呈現多樣性，一些不可培養的(或者常規條件難以培養)細菌、真菌也可能成為魚類病原菌，因此迫切需要革新病原分離鑒定的技術。本文以黃顙魚腹水病病原分離鑒定為例，介紹一種新的魚類細菌性病原分離鑒定方法，供同行參考。

一、16S rDNA高通量測序技術

16S rDNA 高通量測序技術是主要基于細菌16S rDNA 基因在功能上的高度保守性以及又有一定程度的高變性，可以真實全面地反映樣品中細菌群落結構，從而檢測到可培養以及不可培養的細菌種類。隨著現代高通量測序技術的發展，16S rDNA 高通量測序技術已經被普遍使用于各個領域進行細菌多樣性分析。針對水生動物細菌性病原，可采取16S rDNA 高通量測序技術來解決難培養或者不能培養的細菌感染引起的疾病病原確定問題，直接取病樣測序獲取發病魚相應病灶部位及相關組織器官細菌群落，通過高通量獲取細菌種屬信息，從而對可分離培養的細菌制定針對性的分離培養措施，對不可培養細菌也可了解其大致信息以便進行毒力相關研究。

二、應用實例

1.流行病學調查 荊州某黃顙魚養殖場暴發腹水病，筆者對養殖情況、周邊環境、發病史及用藥情況進行調查，分析黃顙魚發病的典型癥狀，并取樣進行液氮保存帶回實驗室進一步分析。

2.16S rDNA 細菌多樣性分析 在無菌條件下，取6 尾具典型患病癥狀的黃顙魚置于操作臺上，用滅菌剪刀將黃顙魚腹部戳破，將腹水分別裝入兩支10毫升的離心管中，一支加入20%甘油置于-80℃冰箱保存待用，另一支送至上海美吉生物醫藥科技有限公司抽提DNA 并在Illumina Mi-Seq平臺上進行高通量測序。

3.特定細菌分離 基于細菌16S rDNA 多樣性測序結果，此次患病黃顙魚的腹水中氣單胞菌屬種類占據絕對優勢，因此使用谷氨酸鹽淀粉酚紅瓊脂從腹水中分離優勢菌，即用接種環蘸取保存的腹水劃線于平板上，28℃培養24 小時后挑取單菌落進一步純化，純化后的細菌加入20%甘油保存于-20℃備用。分離菌株命名為HS01。

4.病原確診 經人工感染試驗，病菌HS01 確定為本次黃顙魚腹水病病原，通過理化特性測定及保守基因分型，確定分離株HS01 為嗜水氣單胞菌，從而確定本次黃顙魚暴發溶血性腹水病的病原是嗜水氣單胞菌。

三、討論

當前水生動物細菌性疾病暴發癥狀呈現多樣性，細菌性病原種類繁多，對于如何確定細菌性病原變得更加艱難。傳統水生動物細菌性病原的確定方法是通過直接對細菌性病原進行分離培養，從而獲得細菌的純培養物，其后利用細菌的純培養物進行回歸感染，看是否出現自然感染癥狀，如出現則進一步對純培養物進行鑒定，如若不是則進行純化細菌。

傳統方法在細菌病原確定方面嚴格遵循了科赫法則，是確定細菌病原的金標準。但隨著現代研究的深入以及細菌病原不斷增多，傳統病原確定方法暴露出了不少缺點，主要集中在病原分離培養方面。傳統細菌性病原確定方法的關鍵手段是獲得細菌性純培養物，而細菌性病原培養條件各不同，有的甚至很苛刻，有厭氧的，有喜寡養，有親富營養的，有本身會自噬的以及其他特殊條件要求等。

我們進行細菌性病原分離時通常使用的是普通培養基如營養瓊脂等或者營養豐富的培養基如腦心浸出液等，更進一步用一些常用的選擇性培養基如TCBS 等，培養條件常為28℃有氧恒溫培養，對于一般常見水生動物細菌性病原能夠分離到，有時雜菌率比較高。而對于一些有特殊要求的病原可能就很難分離純化到，不長或者長得不如常見微生物好的情況經常遇到，還有一些種類是不可培養的，所以導致一部分細菌性疾病病原始終無法準確確定，給細菌性疾病病原確定帶來了嚴重障礙。

16S rDNA 高通量測序技術的引入，使得本次確診更加可信，也改正了傳統水生動物細菌性病原確定的缺點，是對傳統方法的補充與完善。