半胱氨酸雙加氧酶-1甲基化表達對于癌癥早期診斷的意義研究進展

矗日雅，張生彬

（1.內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特；2.內蒙古包鋼醫院，內蒙古 包頭）

0 引言

半胱氨酸雙加氧酶-1是一種金屬蛋白酶，其主要功能是參與半胱氨酸的調節和牛磺酸合成。半胱氨酸雙加氧酶-1通常分布于細胞質中，由位于5q23.2的半胱氨酸雙加氧酶-1基因轉錄表達[1]。近年來研究發現，在結直腸癌、乳腺癌及腦膠質瘤中的發生過程中半胱氨酸雙加氧酶-1存在著表達失活，其啟動子區高甲基化是導致基因功能異常的重要因素[2-3]。抑制半胱氨酸雙加氧酶-1基因啟動子區高甲基化可以恢復半胱氨酸雙加氧酶-1的表達，抑制腫瘤細胞生長。由此認為半胱氨酸雙加氧酶-1具有腫瘤抑癌基因的功能。在對肺癌的研究中發現，NSCLC中存在著普遍的半胱氨酸雙加氧酶-1啟動子區高甲基現象，認為半胱氨酸雙加氧酶-1的甲基化對于NSCLC具有一定的特異性[4]。既往研究[5]表明，在表觀遺傳學水平上發生的DNA甲基化是抑癌基因轉錄失活的重要原因之一，屬于腫瘤發生的早期事件。半胱氨酸雙加氧酶-1基因屬于腫瘤抑制基因，其失活的方式主要通過啟動子的甲基化。對一些腫瘤特異基因的甲基化狀態進行聯合檢測可提高腫瘤在血清學診斷水平上的靈敏度，為癌癥患者的篩查及早期診斷提供新的臨床診斷思路。

1 標本收集

研究組甲的標本為經過篩選的35例合格病例組及20例合格對照組組織及血清樣本[6]。研究組乙的標本為經過篩選的49例合格病例組及16例合格對照組組織及血清樣本[7]。實驗組及對照組組織標本離體后立即置于液氮內保存備用。血清樣本在患者空腹12h后于次日晨間抽取，高速離心機中3000r/min離心10min，吸取上層血清，封裝于2mL凍存管中液氮內保存。

2 檢測方法

2.1 研究組甲組采用基于磁珠的DNA提取和亞硫酸氫鈉修飾技術

取血清樣本1mL，加入組織裂解液及蛋白酶K于55℃消化3h后，加入磁珠（Promega公司），充分混勻后，直接采用磁珠抽提DNA；并采用Zymo公司EZ DNA Methylation kit直接在磁珠上對DNA進行亞硫酸氫鈉修飾，最終獲得可直接用于后續PCR擴增的DNA樣本。取腫瘤標本中心部位組織10mg，加入適量液氮快速充分研磨至勻漿。加入組織裂解液及蛋白酶K過夜消化后，處理步驟同上。擴增CDO1基因，擴增引物由上海Invitrogen公司合成。PCR反應體系如下：10×PCR緩沖液2.5 μl；10mmol/L dNTP混合液 0.5 μl；50mmol/L MgCl20.8μl；Platinum Taq DNA 聚合酶0.2 μl；上游及下游引物各 1 μl；2 μl修飾后的 DNA 模板；雙蒸水17 μl；總體積共 25 μl。反應條件如下：95℃預變性 5 min；94℃變性 30 s，60℃退火 30s，72℃延伸 30s，共循環 45 個周期；72℃終末延伸5min。采用2-ΔCT法判斷實時定量PCR陽性結果[4]。

2.2 研究組乙組采用AxyPrep基因組DNA試劑盒說明對血清標本的DNA進行提取，并應用紫外分光光度計檢測提取的DNA含量和純度。準備DNA樣品，體積20μl，總量約500ng，根據MethylCodeTMBisulfiteConversionKit試劑盒說明行亞硫酸氫鈉修飾。對亞硫酸氫鈉處理后的樣本DNA行PCR擴增引物由上海Invitrogen公司設計。PCR反應體系如下：10×PCR緩沖液2.5 μl；10mmol/LdNTP 混合液 0.5 μl；50mmol/LMgCl20.8μl；PlatinumTaqDNA 聚合酶0.2μl；上游及下游引物各1μl；2μl修飾后的DNA模板；雙蒸水17μl；總體積共25μl。反應條件如下：95℃預變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共循環35個周期；72℃終末延伸5min。MSP產物混合適當的上樣緩沖液，于3.0%瓊脂糖凝膠電泳。

3 結果

經統計學處理后發現：甲組病例組半胱氨酸雙加氧酶-1基因甲基化檢測率為71.4%（25/35），對應的血清檢出率為51.4%（18/35）。對照組中半胱氨酸雙加氧酶-1基因甲基化率為10.0%（2/20），對應的血清檢出率為5.0%（1/20），腫瘤組與對照組之間差異有統計學意義（P＜0.05）。乙組病例組半胱氨酸雙加氧酶-1基因甲基化率為42.9%（21/49），對應的血清檢出率為34.7%（17/49）。所有對照組血漿未檢出CDO1基因甲基化，病例組與對照組之間差異有統計學意義（P＜0.01）。并且上述兩例研究中發現組織與血清中甲化檢出率的一致性較好。雖然上述兩例研究中樣本數量有一定的差距，但研究實驗結果表明，病例組血清中半胱氨酸雙加氧酶-1基因甲基化率要高于對照組，病例組與對照組之間差異均有統計學意義（P＜0.01）。且不論是在組織樣本中還是在血清樣本中，半胱氨酸雙加氧酶-1的檢出率均高，證明其一致性是可靠的。在單因素分析顯示患者血清半胱氨酸雙加氧酶-1基因的甲基化與年齡、性別、腫瘤分級無關。

4 討論

研究證實半胱氨酸雙加氧酶-1作為一種具有抑癌基因功能特征的基因，其基因啟動子區高甲基化與食管鱗癌、乳腺癌、結腸癌、直腸癌等腫瘤的預后密切相關。研究認為半胱氨酸代謝途徑在腫瘤細胞的侵襲過程中發揮著重要作用。半胱氨酸雙加氧酶家族主要包括半胱氨酸雙加氧酶-1和半胱氨酸雙加氧酶-2兩個成員[2-4]。半胱氨酸雙加氧酶-2是一種膜結合蛋白；半胱氨酸雙加氧酶-1是半胱氨酸分解代謝過程的關鍵酶，主要分布于細胞質中，其基因啟動子區異常高甲基化引起基因表達下調，從而影響半胱氨酸代謝，細胞代謝異常，最終導致腫瘤的發生發展。

Brait et al[1]研究得出在不同腫瘤組織中半胱氨酸雙加氧酶-1基因也都存在異常的高甲基化，并表現其相應信使RNA和蛋白質表達下調。研究顯示惡性腫瘤患者外周血中的游離DNA含量較高，這些小片段，半衰期短，極易降解的游離DNA多是由凋亡或壞死的腫瘤細胞釋放而來。一些特異基因啟動子常常被檢測出處于高甲基化狀態，并且這種狀態的改變總伴隨于腫瘤細胞內的抑癌基因的甲基化改變而發生，同時在遺傳特性上的兩者變異是一致的。目前已經可以從外周循環血中檢測到腫瘤相關的基因突變，如EGFR，Kras等，然而DNA甲基化的檢測仍是一個難點[7]。

在方法學方面，甲組研究人員認為傳統的亞硫酸氫鈉修飾過程中會損失大量的DNA，這對于原本就很微量的循環血游離DNA檢測而言，在很長時間里都是難以逾越的障礙。上述研究中采用的基于磁珠的DNA提取和亞硫酸氫鈉修飾技術，在亞硫酸氫鈉修飾過程中最大程度減少了DNA的損失，并采用實時定量PCR技術檢測DNA甲基化信號，極大地增強了檢測的靈敏度和特異性。乙組研究人員認為MSP法檢測DNA甲基化是一種簡單、精確、高效、價格適中的檢測方法。首先，在腫瘤細胞及其相應的正常細胞中，對完全相反狀態（純合甲基化或去甲基化）的靶基因，MSP法能夠從多達104個正常細胞中檢測出1個腫瘤細胞。其次與定量性表達性指標相比，DNA甲基化（為定性指標）狀態不易受患者體內腫瘤因素的影響，使得對腫瘤樣品中非腫瘤細胞污染有高度的抗性。在兩組實驗結果發現血清檢測半胱氨酸雙加氧酶-1啟動子區甲基化與直接從腫瘤組織中檢測在結果上具有極高的一致性，這提示血清檢測DNA中半胱氨酸雙加氧酶-1甲基化對癌癥進行診斷和監測是可行的。

在統計學資料方面，兩組實驗的樣本數量并不大，如果增加樣本含量其半胱氨酸雙加氧酶-1的甲基化檢出率是否會出現誤差還有待研究。且這種單基因的甲基化檢測是否會出現漏診的情況還未知，其組織樣本中是否會出現“假陰性”結果還有待考證，其靈敏度還需大樣本的臨床研究支持。所以在下一步應盡量增加樣本含量，增加其半胱氨酸雙加氧酶-1的甲基化檢出率的靈敏度，在增加樣本含量的同時是否可以采用聯合基因檢測以提高其靈敏度，并且應進一步完善腫瘤DNA甲基化譜。盡量減少實驗步驟以減少系統誤差，避免出現“假陰性”或“假陽性”結果。

綜上所述，研究發現某些癌癥患者血清DNA中存在半胱氨酸雙加氧酶-1基因啟動子區的異常甲基化狀態，且具有極高的特異性，在早期診斷中具有深遠的意義，同時血清標本極易獲得，這又使被檢人群具有良好的依從性。血清游離DNA中半胱氨酸雙加氧酶-1的甲基化檢測可能為癌癥的早期診斷提供全新的臨床思路及價值。