響應面法優化高產多聚谷氨酸菌株凍干保護劑的研究

陳 斐，黃天悅，張旭松，曾 鑫，郭佳強，陳孝平

武漢工程大學環境生態與生物工程學院，湖北 武漢430205

菌種作為生產的源頭，直接關系到最終產品的產量和質量，其重要性不言而喻［1］。為了保證菌種的質量，保持菌種的活力，不管是在基礎的科研工作，還是在微生物的應用研究中，都需要使用正確的菌種保藏方法和技術［2］。而菌種在保藏過程中往往會因為光照、溫度、濕度、營養條件等原因導致菌種的退化，從而影響其經濟效益［3］。目前人們采用的各種菌種保藏方法都是根據不同菌種的生理生化特點，為其提供低溫、干燥的生活條件，使微生物處于休眠或生長停滯狀態，從而使其性狀及遺傳物質保持穩定，達到維系種系的目的［4～6］。真空冷凍干燥是通過將菌體預凍后，使其處在真空環境中進行干燥的方法，屬于低溫升華干燥；此法尤其適用于熱敏性和易揮發物質，而且活菌菌劑經真空冷凍干燥后穩定性強，并且容易保存，是目前制備活菌干燥制劑的主要方法［7］。但是微生物在真空冷凍干燥之后其細胞存活率很低，這是因為處在低溫干燥的環境中微生物細胞及其中某些酶及蛋白質分子會遭到破壞，而導致微生物的死亡。研究表明，為了在低溫干燥過程中不損傷微生物細胞的生物活性，會加入不同的凍干保護劑，使其改變微生物所處的物理或化學環境，從而減少低溫環境對微生物的傷害［8］。

基于每種保護劑不同的保護機制，并且單一的保護劑的添加往往達不到保護菌種的需求，因此通常組合使用幾種不同種類的保護劑來提高真空凍干菌劑中活菌存活率［9］。當不同的保護劑同時存在時，可協同強化保護效果，從而最大化保護菌體細胞。

本試驗通過對枯草芽孢桿菌進行真空冷凍干燥，對復合凍干保護劑配方進行響應面優化，并篩選出其工藝參數，以期制備出高活性T1B菌劑。

1 實驗部分

1.1 材料與設備

菌種：T1B菌株由實驗室分離保存。

試劑：胰蛋白胨、酵母浸粉、明膠、L-谷氨酸鈉、NaCl、C6H5Na3O7·2H2O、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、NH4Cl、KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCl2、FeCl3·6H2O、丙三醇（甘油）、可溶性淀粉、甘露醇、海藻酸鈉、L-半胱氨酸、谷氨酸鈉，以上試劑均為分析純。脫脂奶粉購于雀巢公司。

1.2 培養基

枯草芽孢桿菌活化培養基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L、蔗糖1 g/L，pH調至7.0～7.2。

枯草芽孢桿菌增殖培養基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、L-谷氨酸鈉30 g/L、NaCl 10 g/L、C6H5Na3O7·2H2O 16.8 g/L、蔗糖20 g/L、NH4Cl 7 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、MnSO4·H2O 0.1 g/L、CaCl20.15 g/L、FeCl3·6H2O 0.04 g/L，pH調至7.0～7.2。

LB固體培養基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L、明膠7.5 g/L，pH調至7.0～7.2，用于枯草芽孢桿菌的計數。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程菌種活化→菌種富集培養→冷凍離心收集菌體→添加凍干保護劑→活菌計數→預凍→真空冷凍干燥→凍干菌劑→活菌計數［7］。

1.3.2 凍干劑的優化在單因素試驗確定對細胞凍干存活率影響顯著的保護劑因素的基礎上根據Box-Behnken Design試驗設計原理采用三因素三水平的響應面分析方法進行試驗。

1.3.3 菌體離心收集工藝的優化按照表1設定的參數將T1B菌液進行離心，分別測定其離心損失率和離心存活率。計算不同參數下T1B菌種的存活率，確定最佳離心工藝。

離心存活率、離心損失率、離心收得率計算公式如下：

1.3.4 菌種存活率計算

1.3.5 復合凍干保護劑與菌體沉淀的配比優化將篩選出的復合保護劑與菌體沉淀分別按照體積與質量比為1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1均勻混合制成菌懸液，將pH調至7.0～7.2，進行真空冷凍干燥。比較不同配比下的T1B菌劑凍干存活率，確定最佳配比。

1.3.6 復合凍干保護劑pH對T1B菌劑凍干存活率的影響將實驗1.3.2中篩選出的最佳復合凍干保護劑的pH值調整為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5。并與菌體沉淀混合制成菌懸液，進行真空冷凍干燥。比較不同pH值下的T1B菌劑的凍干存活率，每組實驗重復3次以確定最適值。

2 結果與討論

2.1 菌體離心收集工藝的研究

在制備T1B活菌制劑時，濃縮收集菌體細胞是其中的重要環節，而在工業生產中一般通過離心來收集。低溫離心可促使菌體與其分泌的毒性代謝產物分離，從而提高菌體的存活率。但是在高轉速以及長離心時間的環境中，微生物細胞易受到剪切力的影響，致使細胞破碎，從而降低細胞存活率［10］。按照表2設定參數進行離心，通過檢測離心前初始活菌數、離心后上清液活菌數和沉降細胞活菌數，計算離心損失率、存活率及收得率。結果見表2。

由表2可知，離心損失率和離心存活率隨著離心轉速和時間的不斷增加，兩者都呈現下降的趨勢。其中在4 000 r/min離心10 min條件下離心損失率和離心存活率最高，且離心損失率相互之間差異顯著，而離心存活率相互之間差異不顯著。

在4 000 r/min離心10 min，以及7 000 r/min離心5 min條件下，離心收得率最大，離心效果最好，但最佳離心條件的選擇還需要考慮經濟成本，盡量選取低轉速或較短的離心時間。由表2可知，選擇7 000 r/min離心5 min，所得離心收得率最高，離心效果最好，可達92%以上。

2.2 凍干保護劑單因素的篩選結果

在真空冷凍干燥過程中加入凍干保護劑可降低冷凍干燥對菌體的損害，保持菌體的生物活性及其生理生化特性，提高凍干后菌劑中目的菌種的存活率［11］。參考相關文獻報道［12-13］，選取葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、可溶性淀粉、甘露醇、谷氨酸鈉、L-半胱氨酸、海藻酸鈉、脫脂奶粉作為菌種凍干保護劑進行冷凍干燥，篩選保護效果較好的保護劑。結果見表3。

根據試驗結果，并根據保護劑分子大小的不同將其復配使用，選擇脫脂奶粉質量分數10%、蔗糖質量分數10%、麥芽糖質量分數10%為最優單因素，進行下一步T1B復合凍干保護劑的優化。

2.3 Box-Behnken響應面優化復合凍干保護劑

（1）多元二次回歸模型的建立和方差分析

表2離心轉速和離心時間對T1B的影響Tab.2 Effect of centrifugal speed and time on T1B

表3凍干保護劑單因素試驗結果Tab.3 Results of single factor test of lyophilized protective agent

根據單因素試驗的結果，以脫脂奶粉、蔗糖、麥芽糖3種物質的質量分數3個因素為自變量，T1B凍干存活率為響應值，設計三因素三水平Box-Behnken試驗。試驗設計及結果見表4。

利用Design-Expert 6軟件對表的實驗數據進行二次多項回合擬合，獲得回歸方程：

方程式中，Y為T1B凍干存活率的預測響應值，A，B，C，分別為脫脂奶粉、蔗糖、麥芽糖的編碼值。回歸模型的方差分析見表5。

由表5可知，該模型P值為0.008 5，小于0.01，差異極顯著，即對T1B凍干存活率的影響極顯著；失擬項P值為0.720 6，大于0.05，失擬項差異不顯著，說明模型的擬合度很好，接近實際情況，模型可靠。模型的決定系數R2=97.43%，矯正系數AdjR2=90.12%，說明預測值與實際值之間具有一致性，故此模型可對菌體數量進行分析和預測。

表4 Box-Behnken試驗設計及其結果Tab.4 Box-Behnken design and experimental results

表5響應面二次項模型方差分析Tab.5 ANOVA for response surface quadratic model

由表5可知，回歸方程中各因素影響為顯著和極顯著，說明對T1B凍干存活率的影響較大。

（2）響應面交互作用分析及最優點的尋求

為進一步探究A、B、C的交互作用對響應值的影響，采用Design-Expert 6.0軟件繪制等高線圖及對應的三維響應面圖。具體結果見圖1。

圖1脫脂奶粉A、蔗糖B以及麥芽糖C交互作用等高線圖及相應響應面圖：（a）A：脫脂奶粉與B：蔗糖，（b）A：脫脂奶粉與C：麥芽糖，（c）B：蔗糖與C：麥芽糖Fig.1 Contour maps and corresponding response surface maps of interaction of skimmed milk powder A，sucrose B，and maltose C：（a）skimmed milk powder A and sucrose B，（b）skimmed milk powder A and maltose C，（c）sucrose B and Maltose C

根據圖1的結果，表明脫脂奶粉與蔗糖、脫脂奶粉與麥芽糖以及蔗糖與麥芽糖兩兩之間的交互作用較顯著。凍干存活率都是隨著濃度增加呈現先增大后減小的趨勢。從響應面分析結果可知，當A=7.39，B=9.60，C=10.71時，Y值取得最大值。即當脫脂奶粉濃度為7.39%，蔗糖濃度為9.60%，麥芽糖濃度為10.71%時，T1B菌體的存活率的理論值最大為83.8%。

2.4 復合凍干保護劑與菌體沉淀的配比及最適pH的確定

很多研究學者認為，凍干保護劑的羥基通過氫鍵與蛋白質結合，使蛋白質分子表面形成一層水化膜，穩定蛋白質分子結構，可在低溫干燥環境下維持其完整的結構和功能，因此凍干保護劑的濃度對菌種的凍干存活率也有很大的影響［14-15］。此外復合凍干保護劑的pH值對T1B的存活率也有一定的影響。為確定復合凍干保護劑與菌體沉淀的最佳配比以及復合凍干保護劑的最適pH值，分別測定了保護劑與菌體沉淀的體積質量之比為1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1時T1B的凍干存活率；以及復合保護劑的pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5時T1B的凍干存活率。其結果如圖2所示。

圖2影響T1B的凍干存活率的因素：（a）保護劑與菌泥混合配比，（b）保護劑pHFig.2 Factors of effect on freeze-dried survival rate of T1B：（a）mixing ratio of the protective agent to bacterial mud，（b）protective agent pH

由圖2可知，T1B的凍干存活率隨著保護劑與菌體沉淀之比的逐漸增大有明顯提升，表明在T1B菌體內部和表面上分布足夠多的保護劑，可在最大限度上發揮對菌體的保護作用。當保護劑與菌體沉淀之比繼續增大后，T1B的凍干存活率有少量下降，說明凍干保護劑過量反而會降低菌體的存活率，可能是由于保護劑過多導致細胞的通透性降低，也可能是由于單位體積內的菌體數量較少。當保護劑與菌體沉淀之比為2∶1時，T1B凍干存活率達到最高為83.9%。

在酸性條件下，T1B的凍干存活率隨著保護劑pH的增大而增大。但隨著pH的繼續增大，T1B的凍干存活率呈下降趨勢，表明過大的pH會對T1B的生長產生抑制。當保護劑的pH值升高到7.0時，T1B的凍干存活率達到最大值為84.9%，可能是因為此時的pH最適宜枯草芽孢桿菌生長，能夠在一定程度上提高菌體的存活率。

2.6 復合凍干保護劑效果驗證

將配制好的復合凍干保護劑與T1B菌體沉淀以2∶1的體積與質量比均勻混合制成菌懸液，pH值調整為7.0，進行真空冷凍干燥。其凍干存活率達到85.3%，其凍干菌劑活菌數為1.26×1011cfu/g，最后將凍干菌劑裝入滅菌的凍存管內密封保存。

3 結論

本研究利用響應面法對實驗室分離的一株T1B菌株的凍干保護劑配方進行了優化，確定T1B菌株復合凍干保護劑配方為：脫脂奶粉濃度為7.39%，蔗糖濃度為9.60%，麥芽糖濃度為10.71%，優化后的凍干保護劑在凍干過程中對于T1B菌體保護效果顯著，此時的菌體存活率理論值最大為82.7%，并確定菌體最佳離心條件為7 000 r/min 5 min，復合凍干保護劑適宜pH為7.0，與菌體沉淀的最佳配比為2∶1。經驗證，優化后的凍干存活率達到85.3%。此項研究為枯草芽孢桿菌的復合發酵劑菌劑的實際生產提供了理論參考。