從網絡藥理學探討洋金花治療類風濕關節炎的作用機制

付長龍，梅陽陽，李西海，邱志偉，4，陳長興，鄭春松

1 福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州350122；2 福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州350122；3 福建衛生職業技術學院，福建 福州350101；4 福建中醫藥大學附屬康復醫院，福建 福州350003

* 通信作者：陳長興，E-mail: 1125452554@qq.com

類風濕關節炎是一類以滑膜炎、關節進行性破壞為主要病理基礎的慢性自身免疫性疾病，具有易反復、病程長、高致殘率等特點，其受累關節常伴有疼痛、腫脹、功能障礙甚至畸形，嚴重影響類風濕關節炎患者的健康及生活質量［1-2］。類風濕關節炎歸屬于中醫“痹癥”范疇，基本病機為本虛標實，即以肺、脾、腎3 個臟腑功能減弱為本，風、寒、濕等外邪及痰濁致氣滯血瘀，引起經絡痹阻為標實［3-4］。

洋金花又名鬧洋花、醉心花、鳳茄花、風茄花、白花曼陀羅，其味辛性溫，具有行痹通絡、止痛鎮靜之效，可用于治療風濕痹痛、跌打損傷及慢驚風之痙攣抽搐等，是臨床治療類風濕關節炎常用藥物之一。 《本草綱目》記載：“諸風及寒濕腳氣，煎湯洗之，又主驚癇及脫肛，并入麻藥”，2015 年版《中國藥典》亦刊載其具有重要的藥用價值。 隨著現代醫學的深入發展，洋金花及其提取成分已被藥學、基礎醫學及臨床應用等領域專家廣泛研究，并成為新的研究熱點。 研究表明，洋金花具有調節免疫、抗炎、抑制增殖等功能［5］，其多種活性成分可有效治療類風濕關節炎，減輕類風濕關節炎的滑膜炎癥反應，調節免疫應答，阻止其病理進程進一步發展。 此外，洋金花臨床治療類風濕關節炎具有獨特療效［6-7］。本研究通過網絡藥理學方法，構建洋金花作用于類風濕關節炎靶點的網絡模型和“疾病-藥物-成分-靶點”網絡，篩選與分析網絡中的核心靶點以及相應的功能富集和信號通路，為闡明洋金花治療類風濕關節炎的作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 數據庫和軟件

數據庫和軟件具體應用情況，見表1。

表1 數據庫與軟件匯集Table 1 Collections of database and software

1.2 洋金花有效化合物及靶點篩選

通過中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP），檢索與洋金花相關的所有化學成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 作為篩選指標，篩選出洋金花的有效化合物，通過Uniprot 數據庫將有效化合物的所有蛋白名稱轉化為基因名。

1.3 類風濕關節炎靶點的獲取

通過GeneCards 數據庫和OMIM 數據庫中的Gene map 以“rheumatoid arthritis”為關鍵詞進行已知的類風濕關節炎靶點檢索。

1.4 疾病-藥物-有效化合物-靶點網絡的構建

用R 3.6.3 的韋恩圖（Venn Diagram）包將洋金花靶點和類風濕關節炎靶點取交集并作韋恩圖，作為洋金花治療類風濕關節炎的預測靶基因，利用網絡圖編輯軟件Cytoscape 3.7.1 對獲取的預測靶基因和洋金花有效化合物進行可視化處理，構建疾病-藥物-有效化合物-靶點網絡。

1.5 蛋白質相互作用網絡構建

STRING 數據庫是一個在線搜索已知蛋白相互作用關系的數據庫，本研究采用STRING 7.8 數據庫構建預測靶基因的蛋白相互作用網絡，去除游離節點，為提高可信度，置信度設置為0.9，建立蛋白質相互作用網絡（protein-protein interaction network，PPI）。 將獲得的網絡導入Cytoscape 3.7.1 進行可視化處理，用cytoHubba 插件獲取度值（degree）最高的30 個基因作為核心基因，度值可以反映網絡中某個節點與其他節點相連接的數目，度值越高的節點更傾向于是網絡中的核心基因。

1.6 GO 功能富集分析和KEGG 信號通路分析

利用R 3.6.3 ClusterProfiler 包對洋金花治療類風濕關節炎的預測靶基因進行GO 功能富集分析和KEGG 信號通路分析， 獲得洋金花治療類風濕關節炎的主要功能富集信息和信號通路。

2 結 果

2.1 洋金花有效化合物和作用靶點

在TCMSP 中共檢測到洋金花有效化合物27 個，對應的靶基因318 個，主要化合物包括槲皮素、山柰酚、東莨菪堿、白曼陀羅素、阿托品等。 見表2。

2.2 類風濕關節炎靶點

在GeneCards 數據庫和OMIM 數據庫中共檢索到類風濕關節炎相關靶點4 360 個。

2.3 疾病-藥物-有效化合物-靶點網絡

用Venn Diagram 包共篩選出洋金花治療類風濕關節炎的預測靶基因125 個，見圖1。將預測靶基因和有效化合物導入Cytoscape 3.7.1 進行可視化處理，見圖2。該網絡共有142 個節點，352 條邊。網絡中包含27 個有效化合物，槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、阿托品（scopolamine）、異落葉松脂素［（2R，3R，4S）-4-（4-hydroxy-3-methoxy-phenyl）-7-methoxy-2，3-dimethylol-tetralin-6-ol］、天仙子堿（apohyoscine）、東莨菪堿（hyoscine），分別為104、37、11、11、10。 提示以上關聯性較強的化合物可能是洋金花治療類風濕關節炎的重要組成。

表2 洋金花活性化合物Table 2 Active compounds of hindu datura

2.4 洋金花治療類風濕關節炎預測靶基因的PPI網絡

125 個靶點基因基于STRING 數據庫的PPI 網絡，隱藏游離節點，置信度0.9，見圖3。 該網絡共有125 個節點，452 條邊，平均度值7.23。 每個節點代表一個靶基因， 邊代表節點之間的相互作用關系，邊越多說明該節點在網絡中越重要。 將該網絡導入Cytoscape 進行可視化處理，利用cytoHubba 插件獲得度值最高的30 個基因作為核心基因，見圖4。 由圖可見，Ju-Nana 原癌基因（JUN）、蛋白激酶Bα（PKBα或AKT1）、V-rel 網狀內皮細胞過多癥病毒原癌基因同源物A（RELA）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）度值（degree 依次為：30、29、28、27）明顯高于其余靶點度值（degree均＜22），這提示以上靶點在PPI網絡中發揮了重要的關聯作用，可能是洋金花與類風濕關節炎產生關聯的關鍵作用靶點。

2.5 基因本體功能富集分析

圖1 洋金花靶點與類風濕關節炎靶點韋恩圖Figure 1 Venn diagram of the hindu datura target and rheumatoid arthritis target

圖2 類風濕關節炎-洋金花-預測靶點-有效化合物網絡Figure 2 Network of rheumatoid arthritis-hindu daturapredicted target-effective compound

圖3 預測靶基因構建的PPI 網絡Figure 3 Prediction of PPI network constructed by target genes

基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析包括生物學過程（biological process，BP）、細胞組分（cell component，CC）和分子功能（molecular functions，MF），見圖5。利用R 3.6.3 的ClusterProfiler 包對125 個預測靶基因進行分析，GO 分析中涉及2 313 個條目，包括BP 2 086 條、CC 75 條、MF 152條。 洋金花治療類風濕關節炎的預測靶基因BP 主要涉及脂多糖反應、細菌源性分子的反應、對活性氧的反應、對金屬離子反應、氧化應激反應、類固醇激素反應、活性氧代謝過程、對氧含量的反應等。CC包括膜筏、膜區、質膜筏、突觸前膜的組成部分。 MF涉及到核受體的活性、轉錄因子活性（直接配體調控序列特異性DNA 結合）、類固醇激素受體活性、細胞因子受體結合、細胞因子活性、DNA 結合轉錄激活劑活性、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子結合、 激酶調節活動、受體配體活動等。

圖4 PPI 網絡中的核心基因Figure 4 Core genes in the PPI network

2.6 京都基因和基因組百科全書信號通路分析

利用R 3.6.3 的ClusterProfiler 包，對洋金花治療類風濕關節炎的預測靶基因進行京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路分析，前20 結果，見表3。 主要涉及AGE-RAGE 信號通路、IL-17 信號通路、TNF 信號通路、HIF-1 信號通路和Toll 樣受體信號等關鍵通路。

3 討 論

洋金花在中國古代已被應用于疾病治療。 據《后漢書·華佗傳》記載，古代醫家華佗開展“刳破腹背，抽割積聚”以及“刮骨療毒”等外科手術，與其所創“能令人麻醉，忽而不知人事，任人劈剖，不曉痛癢”的麻沸散密切相關［8］；清代《傷科匯纂》卷七方名的整骨麻藥以“鬧羊花倍用，胡加子、姜黃、川烏、草烏、麻黃各等分”構成，則具有“開取箭頭，服之不痛”之功效［9］，以上組方均以洋金花為主藥，充分驗證了洋金花具有抗炎、鎮痛、抗氧化等作用。 因此，洋金花被廣泛應用于治療風濕痹痛、癲癇、蛇傷、狂犬病等。 在南美洲、歐洲、中東等國外醫學中，洋金花也被用于治療各類疾病，如風濕病、潰瘍、傷口、炎癥、坐骨神經痛等，故又被稱為“萬能神藥”。 此外，還發現洋金花在改善免疫系統疾病方面（類風濕、銀屑病等）也具有良效［10-11］，尤其在干預類風濕性關節炎病程進展方面療效獨特［12］。 這可能與洋金花以下的作用機制有關。

3.1 從網絡藥理學探討洋金花治療類風濕關節炎的作用機制

3.1.1 抗炎鎮痛作用 本研究TCMSP 檢測到洋金花有效化合物27 個，對應的靶基因318 個，主要化合物包括槲皮素、山柰酚、東莨菪堿等。 有研究表明，槲皮素可降低類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞中炎癥因子（interleukin，IL）-1β、6、8 與基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-1、3、13 的含量表達，這可能與抑制NF-κB 的表達相關［13］；山柰酚（3，4'，5，7-四羥基黃酮）作為一種具有羥基苯基鉻酮結構的次生植物代謝物，可調控炎癥反應過程，改善致炎狀態［14］；東莨菪堿對大腦皮層及皮下部位產生抑制作用，其可能通過誘導腦電波由低幅快波轉變為不規則高波幅慢波，增加腦電總功率和低頻成分及其主頻率，進而促使意識喪失，產生麻醉止痛功效［15-16］。這提示，洋金花發揮抗炎鎮痛作用以治療類風濕性關節炎可能與以上活性成分物質密切相關。 這與劉振明等［17-18］研究發現洋金花具有很明顯的鎮痛作用，顯著提高小鼠的痛閾值的研究結果一致。

圖5 GO 功能富集分析Figure 5 GO functional enrichment analysis

表3 KEGG 信號通路Table 3 KEGG signaling pathway

3.1.2 抗氧化作用 在類風濕關節炎介導的慢性疼痛中，外周敏化發揮了重要作用，而外周致敏機制通常因關節炎癥或結構異常損傷直接誘導激活致敏傷害感受器（例如低閾值傷害性纖維），伴隨刺激累及，可最終促使脊髓神經元致敏發生［19］。 在此過程中，多類型激素與趨化因子扮演了重要角色，其中異常氧自由基的含量表達可直接介導炎癥反應，引起疼痛，進而加劇類風濕關節炎的病理進程。 其具體機制為：以自由電子的形式形成局部負電位，釋放電子匯聚成電子流，并趨向高電位的痛覺神經末梢，當電子流刺激達到閾值電位時，Na+、K+通道開放，膜電位翻轉，產生了動作電位，引起疼痛［20］。 有研究表明，洋金花甲醇提取物、總生物堿、有效活性成分（槲皮素、山柰酚）等具有較強的抗氧化作用［21-23］，可增加抗氧化劑的表達酶表達，提高血液中超氧化歧化酶的活力，抑制丙二醛含量，降低細胞損傷，從而調節氧化應激反應，介導炎癥反應過程。 這提示，洋金花治療類風濕性關節炎可能與其抗氧化作用有關。

3.2 洋金花通過調控與炎癥反應相關信號途徑發揮治療類風濕性關節炎作用

本研究網絡藥理學分析結果顯示，洋金花通過調控與炎癥反應相關信號途徑發揮治療類風濕性關節炎作用，其具體作用途徑及過程包括：

3.2.1 調節活化階段 受病理性致炎因素刺激后，炎癥因子可與細胞膜受體發生特異性結合，通過跨膜信息遞進，誘導胞內絲／蘇氨酸蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號活化。活化后的MAPK 信號可進一步啟動級聯效應，直至將跨膜信息移至細胞核內，并特異性激活相關轉錄因子，產生轉錄效應，進而參與細胞的多種生物學反應。

3.2.2 調節轉錄階段 受到壓應力異常改變或炎癥刺激因素影響，其信息調控從胞外向胞內傳遞，再到引起生物學效用，需要MAPK 途徑的級聯反應（三級激酶）的參與。 在此過程中激活型Ras 通過級聯反應活化Raf 轉錄因子，一旦發動該反應后續又可依次激活絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MAPKK 或MEK）與細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）（其中ERK2 即MAPK1），而ERK 作為Ras 途徑的重要下游部分，是連接胞質至細胞核內信息轉錄的關鍵媒介，一旦被磷酸化激活，即轉變為p-ERK1／2，可引起下游相關轉錄因子（C-JUN 等）活化，由此介導炎癥反應［24］。

3.2.3 調控效應（致炎）階段 有研究發現，TNF-α與ERK 信號途徑具有密切聯系，TNF-α 可產生放大ERK 信號途徑的活化效用［25］，此外，IL-1β 可上調細胞中C-MYC 含量表達，并影響C-MYC 等相關信號轉錄過程［26］。 受磷酸化作用而被活化的p-ERK1／2 可作用于多類活性底物，其中可針對內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitricoxide synthase，eNOS）與誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）并致使其活化，誘導精氨酸發生氧化產生NO，參與氧化應激反應［27］。而AKT1（又稱為蛋白激酶B）作為絲／蘇氨酸蛋白激酶家族中的重要成員之一，亦參與了多種生物學過程（代謝、增殖、血管生成等）。 研究表明，RELA 基因在調控炎癥的細胞信號系統—NF-κB 信號通路中起著極其重要的作用［28］。 而當其遭受外界壓力變化、異常細胞因子（脂多糖、TNF-α 與IL-1 等）與自由基（NO 等）作用、紫外線照射影響及細菌或病毒抗原發生結合反應等一系列刺激后，可激活NF-κB 經典途徑，而此通路的活化又可加劇炎癥反應的程度［29］。 綜上，洋金花可能通過調控以上相關信號途徑及信號分子發揮作用。

4 小 結

隨著計算機技術的普及應用，網絡藥理學已成為一種研究中藥有效成分及其作用機理的新途徑。本研究基于網絡藥理學研究發現洋金花可通過多途徑、多靶點發揮抗炎鎮痛及抗氧化作用治療類風濕關節炎；推測其機制可能與槲皮素、山柰酚、東莨菪堿等活性物質有關，并調控相關信號分子及信號途徑抑制炎性反應和氧化應激反應。 這可為進一步開展洋金花防治類風濕關節炎作用機制的基礎研究提供一定的理論依據［30-31］。

但本研究仍存在一些不足之處，如：①洋金花治療類風濕關節炎作用途徑間的交互影響機制及其是否通過影響關聯的非編碼長鏈RNA 或微小RNA等微介質成分的調控機制仍需進一步研究；②洋金花的活性成分（槲皮素、山柰酚、東莨菪堿等）治療類風濕關節炎的深層次效用機制及有效成分間的聯合應用研究亦需要進一步探討。