過表達(dá)硫氧還蛋白-1抑制戊四氮致癲癇大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡①

甘 露 周弟彌 張 磊 陳 琳

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，衡陽 421001)

癲癇是全球常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未明確。任何引起大腦生理結(jié)構(gòu)或功能紊亂的因素均可能導(dǎo)致癲癇，威脅各年齡階段人群[1,2]。研究報道，全球約有7 000萬癲癇患者，我國癲癇患者約占全球的13%[3]。目前，癲癇的主要治療方式是抗癲癇藥物治療，但仍有25%～30%的患者發(fā)展為耐藥性癲癇，治療效果并不理想[4]。尋找治療癲癇的新方法成為急需解決的問題。硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的抗氧化分子，可通過抗氧化效應(yīng)減輕神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[5]。Trx與Trx還原酶(TrxR)及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NADPH)組成硫氧還蛋白系統(tǒng)，發(fā)揮抗氧化功能，并參與調(diào)控戊四氮(pentylenetet-razol，PTZ)點燃致癲癇小鼠模型氧化應(yīng)激過程[6,7]。Trx-1是Trx蛋白家族中的主要成員，參與氧化還原反應(yīng)，并通過凋亡信號通路調(diào)控細(xì)胞凋亡[8]。本研究擬通過PTZ誘導(dǎo)大鼠癲癇模型，并采用Trx-1過表達(dá)慢病毒進(jìn)行干預(yù)，探討其對大鼠海馬組織神經(jīng)元損傷及細(xì)胞凋亡的影響，以期為癲癇的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 40只健康清潔級SD大鼠(長沙市天勤生物技術(shù)有限公司)，動物合格證號：SCXK(湘)2014-0010，體質(zhì)量230～250 g，7～8周齡。

1.1.2試劑 載體(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司)；引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)；TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司)；SYBR Green PCR試劑盒(美國KAPA Biosystems公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京康為世紀(jì)公司)；兔抗Trx-1多克隆抗體(美國CST公司，貨號：#2298)；兔抗B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)多克隆抗體、兔抗Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)多克隆抗體、兔抗磷酸化c-Jun末端激酶(phospho c-Jun N-terminal kinase，p-JNK)單克隆抗體、兔抗凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal regulating kinase-1，ASK1)多克隆抗體(美國Abcam公司，貨號：ab 196495、ab53154、ab124956、ab1315 06)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(美國Promega公司)。

1.1.3儀器 ChemiDoc Touch系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1Trx-1過表達(dá)重組慢病毒載體設(shè)計及合成 根據(jù)Trx-1基因序列，設(shè)計合成含Trx-1和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的慢病毒載體(ov-Trx-1-GFP)及陰性對照慢病毒載體(NC-GFP)，慢病毒載體滴度為5×108TU/ml。

1.2.2動物分組及處理 40只SD大鼠隨機(jī)分為4組：對照組、模型組、Trx-1過表達(dá)組和陰性對照組，每組10只。大鼠腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)，麻醉后固定于立體定位儀中，Trx-1過表達(dá)組大鼠兩側(cè)海馬區(qū)注射2.5 μl ov-Trx-1-GFP慢病毒溶液，陰性對照組大鼠于相同位置注射等量的NC-GFP慢病毒溶液，對照組和模型組注射等量生理鹽水。慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠海馬區(qū)14 d后構(gòu)建PTZ點燃癲癇模型。

1.2.3建模 除對照組外，其他組大鼠腹腔反復(fù)注射PTZ(35 mg/kg)，對照組注射等量生理鹽水，1次/d。注射PTZ 1 h后觀察大鼠狀態(tài)及行為變化，記錄大鼠癲癇驚厥情況。根據(jù)Smialowki癲癇發(fā)作分級標(biāo)準(zhǔn)評估大鼠癲癇驚厥級別，0級：無反應(yīng)；1級：面部運動，指鼻子、點頭、奔跑；2級：前肢痙攣；3級：前肢痙攣伴后退；4級：前肢痙攣伴后退及摔倒發(fā)作；5級：摔倒、強(qiáng)直發(fā)作[9]。連續(xù)注射3 d PTZ后，大鼠的癲癇發(fā)作級別均為4～5級則視為建模成功。模型建立成功后，大鼠麻醉斷頭取腦，分離海馬組織，一部分采用4%多聚甲醛固定，另一部分-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4RT-PCR檢測Trx-1 mRNA相對表達(dá)量 TRIzol提取海馬組織總RNA，試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。Trx-1引物序列為：F：5′-TTCTTTCATTCCCTCTGTG-3′，R：5′-TCCGTAATAGTGGCTTCG-3′，內(nèi)參基因GAPDH引物序列：F：5′-CCACTCCTCCACCTTTG-3′，R：5′-CACCACCCTGTTGCTGT-3′。 2-ΔΔCt法計算。

1.2.5Western blot檢測蛋白相對表達(dá)量 提取各組海馬組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白上樣量為20 μl,轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。PBST洗膜后加入一抗稀釋液(1∶1 000)，室溫孵育1 h。PBST洗膜，加入二抗稀釋液，室溫孵育1 h。PBST洗膜，滴加化學(xué)發(fā)光試劑顯影，ChemiDoc Touch系統(tǒng)采集圖像，以GAPDH為內(nèi)參計算其他蛋白相對表達(dá)量。

1.2.6HE染色觀察海馬組織形態(tài) 取固定海馬組織，常規(guī)制片：組織脫水，浸蠟包埋，切成4 μm厚片，脫蠟至水。加入蘇木素染液染色3 min，流水沖洗后加入1%鹽酸乙醇分化1 min。流水沖洗，加入促藍(lán)液返藍(lán)1 min，洗滌后加入伊紅染液染色3 min。乙醇脫水，二甲苯通透，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7TUNEL染色觀察海馬組織細(xì)胞凋亡 將海馬組織切片進(jìn)行脫蠟脫水處理，按照TUNEL凋亡檢測試劑盒說明書操作，顯微鏡下觀察海馬組織細(xì)胞凋亡情況，統(tǒng)計3個切片TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

2 結(jié)果

2.1大鼠行為觀察 PTZ連續(xù)注射8 d后，模型組和陰性對照組大鼠出現(xiàn)1級驚厥發(fā)作，15 d后，Trx-1過表達(dá)組大鼠出現(xiàn)驚厥發(fā)作，20 d后，模型組和陰性對照組大鼠連續(xù)3 d均表現(xiàn)出4～5級癲癇驚厥行為，說明PTZ成功點燃癲癇模型，PTZ點燃成功后，對照組大鼠未出現(xiàn)驚厥發(fā)作，模型組與陰性對照組大鼠驚厥發(fā)作時間長、級別高，而Trx-1過表達(dá)組大鼠驚厥時間明顯縮短，級別明顯降低(P<0.01)。見表1。

表1 大鼠癲癇發(fā)作情況比較Tab.1 Comparison of epileptic seizures in

2.2Trx-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平 與對照組相比，模型組大鼠海馬組織Trx-1表達(dá)顯著降低(P<0.01)，與模型組相比，Trx-1過表達(dá)組Trx-1表達(dá)顯著升高(P<0.01)，說明Trx-1過表達(dá)重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染成功。見圖1。

圖1 Trx-1 mRNA及蛋白表達(dá)Fig.1 mRNA and protein expressions of Trx-1Note:Compared with control group,**.P<0.01;compared with model group,##.P<0.01.

2.3Trx-1過表達(dá)對大鼠海馬組織形態(tài)的影響 對照組細(xì)胞排列整齊緊密，細(xì)胞輪廓清晰，無明顯病變。模型組和陰性對照組細(xì)胞形狀不規(guī)則，排列疏松，細(xì)胞核固縮深染，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)嚴(yán)重空泡化。與模型組相比，Trx-1過表達(dá)組海馬神經(jīng)元損傷減輕，細(xì)胞輪廓較清晰，排列整齊，細(xì)胞質(zhì)空泡化程度降低。見圖2。

圖2 HE染色觀察海馬組織形態(tài)(×200)Fig.2 Hippocampus morphology observed by HE staining(×200)

2.4Trx-1過表達(dá)對大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色觀察各組海馬組織細(xì)胞凋亡水平，結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組和陰性對照組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.01)，與模型組相比，Trx-1過表達(dá)組細(xì)胞凋亡數(shù)顯著減少(P<0.01)。見圖3。

圖3 各組海馬組織凋亡細(xì)胞數(shù)比較Fig.3 Comparison of apoptotic cells in hippocampus of each groupNote:Compared with control group,**.P<0.01;compared with model group,##.P<0.01.

2.5Trx-1過表達(dá)對大鼠海馬組織凋亡相關(guān)蛋白的影響 與對照組相比，模型組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)，而Bax、ASK1和p-JNK蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，Trx-1過表達(dá)組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)，而Bax、ASK1和p-JNK蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)。見圖4。

圖4 Trx-1過表達(dá)對Bcl-2、Bax、ASK1和p-JNK蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Trx-1 overexpression on proteins expressions of Bcl-2,Bax,ASK1 and p-JNKNote:Compared with control group,**.P<0.01;compared with model group,##.P<0.01.

3 討論

癲癇是一種復(fù)雜的神經(jīng)綜合征，具有刻板性、發(fā)作性和反復(fù)性等特點，全球90%以上的癲癇發(fā)生于中低收入水平國家，且伴有認(rèn)知、心理及生理學(xué)等方面的并發(fā)癥[10,11]。癲癇主要由多種因素導(dǎo)致大腦神經(jīng)元過度興奮和突然的同步放電引發(fā)，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[12]?？拱d癇藥物治療效果不理想，對癲癇發(fā)病機(jī)制及新型治療方法的研究對改善癲癇治療現(xiàn)狀具有重要意義。

ASK1在生物體內(nèi)具有重要的生理功能，特別是在應(yīng)激條件下，對氧化應(yīng)激高度敏感，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激及炎癥信號等激活，過度活化后的ASK1可激活下游JNK通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引起組織形態(tài)學(xué)改變及多種應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)多種疾病[13,14]。JNK是絲裂原活化蛋白激酶家族主要成員，JNK信號傳導(dǎo)可參與外源性凋亡途徑及線粒體引發(fā)的內(nèi)源性凋亡途徑，是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，抑制腫瘤發(fā)展[14,15]。研究顯示多種磷酸化信號通路與遺傳因素和后天性腦損傷引起的癲癇發(fā)病機(jī)制相關(guān)，在癲癇動物模型中發(fā)現(xiàn)JNK存在過度激活，推測JNK介導(dǎo)的磷酸化信號可能是一種新的抗癲癇治療靶點[16]。Trx作為ASK1信號的調(diào)控成分之一，可通過調(diào)節(jié)ASK1/JNK信號通路調(diào)控細(xì)胞凋亡[13]。研究發(fā)現(xiàn)，Trx-1/Trxr-1系統(tǒng)參與胸腺細(xì)胞內(nèi)ASK1及JNK磷酸化過程，上調(diào)該系統(tǒng)表達(dá)水平及控制細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)穩(wěn)定對胸腺細(xì)胞的存活至關(guān)重要[17]。Wong等[18]研究結(jié)果也證實了Trx-1是一種內(nèi)源性抗凋亡分子，可通過抑制ASK1-JNK/p38信號通路減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，減輕腦缺血再灌注損傷。

PTZ是一種中樞系統(tǒng)興奮劑，在神經(jīng)元完好的情況下，反復(fù)注射PTZ可誘導(dǎo)慢性癲癇動物模型[18]。本研究采用PTZ誘導(dǎo)大鼠癲癇模型，模型組大鼠癲癇發(fā)作時間長、級別高，海馬組織出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，細(xì)胞凋亡增加，經(jīng)過Trx-1過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染干預(yù)后，癲癇大鼠的癲癇驚厥發(fā)作時間縮短，級別降低，海馬組織損傷減弱，且細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)上調(diào)，而促凋亡基因Bax、ASK1及p-JNK表達(dá)下調(diào)。綜上，過表達(dá)Trx-1對癲癇具有較好的治療作用，可減緩海馬組織損傷及細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與下調(diào)ASK1/JNK信號通路有關(guān)。