趨化因子CXCL5通過調控ERK/MAPK信號通路抑制腫瘤免疫促進鼻咽癌惡化的機制研究①

阮 鵬 譚愛麗

(武漢大學人民醫院腫瘤科,武漢 430060)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是耳鼻咽喉惡性腫瘤的主要癌種和病死原因，70%的患者被確診時已是晚期[1,2]。隨著我國人口老齡化不斷加快，NPC的發病率與死亡率可能還將不斷上升，由此帶來的癌癥負擔也將持續增長[1,3]。目前，NPC的治療仍以放化療為主，遠處轉移是治療失敗的主要原因[4]。腫瘤免疫已成為近年腫瘤研究的熱點之一，越來越多的研究表明免疫治療在腫瘤中有著廣闊前景[5,6]。腫瘤的免疫治療利用腫瘤的免疫學特性改變機體的抗腫瘤免疫應答水平，進而殺傷與抑制腫瘤[7]。研究證實，多種細胞因子在腫瘤免疫中發揮作用，已被用于腫瘤的免疫治療[8]。

趨化因子是指能使細胞發生趨化運動的細胞因子，不僅參與了免疫反應，也是腫瘤發生發展的重要調節因子[9]。CXC趨化因子配體-5(CXC chemokine ligand-5，CXCL5)是CXC趨化因子的家族成員[10]。CXCL5可通過與其特異性受體CXCR2結合介導一系列生物學效應進而促進腫瘤的生長、浸潤和轉移[11]。報道指出，CXCL5在多種腫瘤組織中的表達高于正常組織[12-15]。而針對CXCL5在NPC中的作用尚無報道，本次研究的目的是探討CXCL5在NPC中的作用及其潛在的分子機制。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 本次研究共納入2017年6月～2019年2月我院收治的98例NPC患者作為研究對象；其中男性59例，女性39例；年齡26～63歲，平均年齡(43.7±12.4)歲。參照中華醫學會頭頸外科學分會制定的NPC診斷標準對所有患者進行診斷，所有患者均經病理活檢或術后病理學確診，均未進行過任何治療。所有患者的TNM分期：Ⅰ期9例、Ⅱ期24例、Ⅲ期41例、Ⅳ期24例；病理學分型：Ⅰ型5例、Ⅱ型11例、Ⅲ型82例。排除標準：①近期或長期服用影響機體免疫藥物的患者；②有放化療史的患者；③復發性NPC患者；④并發其他腫瘤患者；⑤臨床資料不全的患者；⑥伴有嚴重心肝腎功能障礙的患者；⑦伴有全身感染性疾病的患者；⑧長期營養不良患者；⑨妊娠期或哺乳期女性。另選取38例同期在我院進行體檢的健康志愿者作為對照，其中男性24例，女性14例；年齡29～67歲，平均年齡(46.1±17.3)歲。兩組患者的性別、年齡相比差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2實驗動物與主要試劑 人CXCL5 ELISA試劑盒(美國R&D Systems)；重組人CXCL5蛋白(武漢艾美捷科技有限公司)；CXCL5抗體、p-AKT抗體、AKT抗體、p-ERK1/2抗體、ERK1/2抗體、p-MAPK抗體、MAPK抗體、p-NF-κB抗體、NF-κB抗體(美國Santa Cruz公司)；p-PI3K抗體、PI3K抗體、β-actin抗體(美國Abcam公司)；ERK/MAPK信號通路特異性抑制劑SCH772984(美國Selleckchem公司)；流式抗體包括：APC標記的CD4抗體、FITC標記的CD8抗體、PE標記的CD16抗體、FITC標記的CD56抗體(美國BioLegend公司)；DMEM培養基、胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司)；青霉素、鏈霉素(美國Sigma公司)；Lipofectamine?2000轉染試劑(Thermo Fisher)；小鼠淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品科技有限公司)；SDS-PAGE試劑(上海碧云天生物技術有限公司)；BALB/c小鼠及CNE-2細胞購自武漢大學實驗動物中心。

1.1.3主要設備 CO2培養箱、超凈工作臺、流式細胞儀、Bio-Rad垂直電泳儀、Western blot化學發光成像系統購自Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1ELISA 抽取NPC患者和健康志愿者清晨空腹靜脈血10 ml，置于促凝管中，自然凝固后將樣品1 000 g離心20 min之后進行直接檢測或于-80℃儲存待檢。按照產品說明書，使用CXCL5 ELISA試劑盒檢測患者的血清CXCL5水平，采用Tecan酶標儀進行測量。

1.2.2細胞處理 構建pLenti-CMV-CXCL5過表達質粒，采用Lipofectamine?2000轉染293T細胞包裝慢病毒，慢病毒感染CNE-2細胞后用嘌呤霉素篩選穩定表達CXCL5的CNE-2細胞。用Western blot檢測對照與穩定表達CXCL5的CNE-2細胞中PI3K/AKT、ERK/MAPK及NF-κB信號通路的表達水平。

1.2.3Western blot 研磨NPC患者腫瘤及癌旁正常組織或小鼠腫瘤組織，采用RIPA裂解液(含cocktail蛋白酶抑制劑)進行裂解提取總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。配置12%的分離膠和5%的濃縮膠，每孔上樣80～120 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉至PVDF膜。經5%BSA封閉后，分別加入CXCL5抗體、p-AKT抗體、p-ERK1/2抗體、p-MAPK抗體、p-PI3K抗體、p-NF-κB抗體(1∶1 000)；AKT抗體、ERK1/2抗體、MAPK抗體、PI3K抗體、NF-κB抗體(1∶2 000)；β-actin抗體(1∶5 000)，4℃孵育過夜，經洗滌，加入二抗(1∶5 000)孵育，洗滌，DBA顯色。

1.2.4免疫組化染色 每例患者和健康志愿者各取1塊活檢標本并用10%甲醛溶液固定過夜后石蠟包埋。采用SP法檢測組織CXCL5、CXCR2或p-ERK1/2的水平。將所有石蠟切片常規脫蠟至水，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)高壓鍋抗原熱修復，加3%H2O2室溫避光孵育30 min，PBS洗滌5 min×3次。用10%正常非免疫羊血清37℃孵育60 min，滴加CXCL5或p-ERK1/2一抗工作液，4℃過夜，PBS洗5 min×3次。滴加二抗工作液，37℃孵育60 min，PBS洗5 min×3次。滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素，37℃孵育60 min，PBS洗5 min×3次。DAB顯色、蘇木素復染、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡下每個切片隨機選取5個視野進行拍照。計算陽性染色的平均光密度。

1.2.5小鼠模型的建立 取對數期生長的對照與穩定表達CXCL5的CNE-2鼻咽癌細胞，胰酶消化，1 000 r/min 離心5 min，計數后調整細胞濃度至1.0×107個/ml的單細胞懸液，無菌條件下接種于小鼠左前肢腋窩結合部皮下，0.1 ml/只。接種后每隔1 d觀察一次小鼠，連續觀察60 d，觀察時記錄小鼠的腫瘤大小和死亡情況。繪制小鼠的腫瘤生長與生存曲線。IHC與Western blot分析各組小鼠腫瘤組織中CXCL5與p-ERK1/2的表達水平。流式細胞術檢測各組小鼠甲狀腺癌組織中CD4+T細胞、CD8+T細胞與CD56+CD16+NK細胞數量。

1.2.6流式細胞術檢測 取新鮮小鼠鼻咽癌腫瘤組織，RPMI1640培養基中消化過夜后進行研磨，經不銹鋼網過網，制成單細胞懸液，將細胞懸液加入離心管，根據說明書加入適當比例的待測抗體(CD4、CD8、CD56或CD16)，混勻后室溫避光孵育30 min。1 500 r/min離心5 min，棄上清。加PBS洗5 min×3次，棄上清。加0.5 ml PBS重懸細胞，混勻上流式細胞儀檢測。

1.2.7NK細胞活性檢測 根據產品說明書分離BALB/c小鼠的PBMC。將分離的PBMC進行體外培養，分別用重組CXCL5與ERK/MAPK抑制劑SCH77298處理。計數細胞，按2×105個/孔鋪于96孔板中。將CNE-2細胞作為靶細胞，按效應細胞∶靶細胞=50∶1加入靶細胞，并設效應細胞和靶細胞對照，每孔總液量200 μl，于培養箱中孵育4 h后棄去100 μl上清，加入15 μl MTT再孵育4 h，每孔加100 μl MTT溶解液培養箱孵育8 h，酶標儀測570 nm OD值(參考波長630 nm)。根據以下公式計算：NK細胞活性=[靶細胞對照孔OD-(反應孔OD-效應細胞對照孔OD)]/靶細胞對照孔OD。

2 結果

2.1患者的基本信息 研究初期共納入123例NPC患者，其中7例近期或長期服用影響機體免疫藥物；5例有放化療史；5例為復發性鼻咽癌；2例并發其他腫瘤；2例臨床資料不全；1例伴有嚴重心肝腎功能障礙；1例伴有全身感染性疾病；1例長期營養不良；1例妊娠期女性。

2.2NPC患者血清及組織CXCL5水平分析 ELISA結果顯示，NPC患者的血清CXCL5水平顯著高于健康志愿者[(247.9±23.6)ng/L vs(144.8±14.7)ng/L,P<0.05]。IHC與Western blot結果顯示，NPC患者腫瘤組織中CXCL5與CXCR2的水平均顯著高于癌旁正常組織(P<0.05)，見圖1。

圖1 NPC患者血清及癌組織CXCL5水平Fig.1 Expression of CXCL5 in serum and tumor tissue of NPC patientsNote:A.ELISA analysis;B.IHC staining result (×20);C.Western blot of 8 NPC patients.***.P<0.001 vs Healthy Normal.

2.3腫瘤CXCL5水平與臨床特征的關系 根據患者腫瘤組織中CXCL5的表達水平，以所有患者的平均光密度值為界限將所有患者分為CXCL5低表達組(CXCL5Low)與CXCL5高表達組(CXCL5High)。CXCL5低表達組55例，CXCL5高表達組43例。NPC患者中CXCL5高表達與CXCL5低表達組的年齡、性別、原發腫瘤范圍與病理學分型相比差異無統計學意義(P>0.05)。CXCL5高表達組患者的TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移的發生率均顯著高于CXCL5低表達組(P<0.05)，見表1。

表1 腫瘤組織CXCL5與臨床特征的關系Tab.1 Relation between level of CXCL5 in tumor tissues and clinical characteristics

2.4CXCL5對NPC細胞信號通路的影響 Western blot顯示CXCL5過表達與重組CXCL5蛋白(rCXCL5)處理能顯著提高CNE-2細胞p-ERK1/2與p-MAPK的表達水平，而不影響p-PI3K、p-AKT與p-NF-κB的表達提高，見圖2。

圖2 CXCL5對NPC細胞信號通路的影響Fig.2 Effect of CXCL5 on signal pathways of NPC cellsNote:A.Effect of CXCL5 overexpression on PI3K/AKT,ERK/MAPK and NF-κB signals of CNE-2 cells；B.Effect of rCXCL5 (100 ng/ml) on PI3K/AKT,ERK/MAPK and NF-κB signals of CNE-2 cells.

2.5小鼠模型的建立與分析 CXCL5過表達組小鼠的腫瘤生長曲線與生存曲線與對照組小鼠具有顯著差異(P<0.05)。Western blot結果顯示過表達CXCL5組小鼠腫瘤組織CXCL5與p-ERK1/2的表達水平均顯著高于對照組小鼠。流式分析顯示過表達CXCL5組小鼠腫瘤組織中CD4+T細胞、CD8+T細胞與CD56+CD16+NK細胞數量均顯著低于對照組小鼠(P<0.05)，見圖3。

圖3 小鼠模型分析Fig.3 Mice model analysisNote:A.Photographic illustration of tumors from mice;B.Tumor growth curve of mice;C.Survival curve of mice;D.Expression level of CXCL5 and p-ERK1/2 in mice tumor tissue;E.Flow cytometry analysis of CD4+ T and CD8+ T cells in mice tumor tissue;F.Flow cytometry analysis of CD56+CD16+ NK cells in mice tumor tissue.***.P<0.001 vs vector.

2.6CXCL5對NK細胞活性的影響 分離正常BALB/c小鼠PBMC，分別用rCXCL5與SCH772984處理。rCXCL5能顯著降低PBMC中NK細胞的活性，而不影響ERK/MAPK信號通路抑制劑SCH772984預處理的PBMC中NK細胞的活性(P>0.05)，見圖4。

圖4 rCXCL5對PBMC中NK細胞活性的影響Fig.4 Effect of rCXCL5 on activity of NK cells in PBMCNote:***.P<0.001 vs Normal.

3 討論

NPC的浸潤性高、侵襲性強，臨床上以放射治療為主要治療策略[1,4]。近年來，隨著放療技術的進步與綜合治療的進展，NPC的療效有所提高[2,4]。早期NPC患者的療效尚可，5年生存率可達80%以上[2]。然而，由于鼻腔位置隱蔽，且臨床癥狀表現多樣，約75%的患者確診時已是中晚期，其5年生存率不到50%[2,4]。針對這類患者，臨床多采用放療、化療與分子靶向相結合的綜合治療策略[4]。隨著研究的不斷深入，已經發現許多基因與鼻咽癌的發生、發展、局部淋巴轉移等密切相關[2]。分子靶向治療，如靶向表皮生長因子受體、血管生成抑制劑與環氧化酶(COX)-2抑制劑的治療已逐步應用于臨床并取得一定的進展[2,4]。而NPC的發病機制尚未被完全闡明。因此，進一步探討NPC的發病機制，尋找新的治療靶點至關重要。本研究旨在探討趨化因子CXCL5通過抑制腫瘤免疫促進NPC的作用，并研究其潛在的分子機制。

CXCL5又名上皮來源的中性粒細胞活化肽78(ENA-78)，可通過ELR功能區與其特異性受體CXCR2結合，進而促進血管新生，介導腫瘤的生長、浸潤和轉移[12,16]。近年來，CXCL5在腫瘤中的作用逐漸引起人們的關注。研究指出，CXCL5在肝癌、胃癌、前列腺癌、非小細胞肺癌等腫瘤組織中的表達顯著升高，CXCL5可促進胃癌與非小細胞肺癌等腫瘤的發生、發展與轉移[12-15]。而針對CXCL5在鼻咽癌中的作用尚無人報道，本研究結果顯示，NPC患者的血清與腫瘤組織中的CXCL5水平均出現顯著升高，且過表達CXCL5組小鼠的生存曲線和移植瘤生長曲線均顯著差于對照組小鼠，提示CXCL5及其受體CXCR2可能參與了鼻咽癌的發生與發展機制。

研究指出，鼻咽癌腫瘤組織中的p-ERK1/2水平顯著高于正常組織，ERK/MAPK信號通路的持續激活可能參與了NPC的發生與發展過程[17,18]。本研究顯示，重組CXCL5蛋白能顯著增加CNE-2細胞p-ERK1/2與p-MAPK的表達水平，而不影響p-PI3K、p-AKT與p-NF-κB的表達水平，提示CXCL5可能通過ERK/MAPK信號通路發揮促NPC的作用。

近年來，免疫治療已經成為腫瘤學的一個熱門研究方向[5]。目前免疫治療已在黑色素瘤、淋巴瘤等的治療中取得良好療效[6]。針對NPC的免疫治療主要有腫瘤疫苗、免疫節點抑制劑及過繼性免疫治療等[19]。本研究顯示，過表達CXCL5組小鼠腫瘤組織中CD4+T細胞、CD8+T細胞與CD56+CD16+NK細胞數量均顯著低于對照組小鼠。且重組CXCL5處理能顯著降低小鼠PBMC中NK細胞的活性，而不影響ERK/MAPK信號通路抑制劑SCH772984預處理的PBMC中NK細胞的活性。因此，CXCL5可能通過ERK/MAPK信號通路發揮抑制NPC腫瘤免疫的作用。

綜上所述，NPC患者血清及腫瘤組織中CXCL5表達水平均顯著增高，CXCL5可能通過調控ERK/MAPK信號通路抑制CD4+T細胞、CD8+T細胞和NK細胞的活性進而發揮促進鼻咽癌的作用。