黃芩苷激活膽堿能抗炎途徑改善脂多糖誘發的子癇前期大鼠癥狀

李亞梅 王燕俠

(甘肅省婦幼保健院科研中心，復發性流產診所，蘭州 730000)

子癇前期(preeclampsia,PE)是一種在妊娠20周以后出現高血壓、蛋白尿等癥狀的多系統疾病。PE在孕婦中的發生率約為2%～8%，是導致早產、新生兒和產婦死亡的主要原因[1]。然而，對PE的治療仍然是一個挑戰，目前尚缺乏對其的有效治療方法[2]。正常妊娠會引起輕度的全身炎癥反應，而PE與過度的炎癥反應相關[3]。來自動物和人類研究的數據顯示，炎癥介質在PE的發病機制中發揮重要作用[4]。臨床研究表明，PE婦女比正常血壓婦女表現出更高的血清和胎盤促炎輔助性Th1細胞因子水平[5]。此外，研究表明母體通過核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)激活免疫細胞是炎癥的關鍵調節途徑[6]。

越來越多的證據表明，迷走神經可以有效調節炎癥反應，迷走神經被稱為膽堿能或煙堿類抗炎途徑[7-9]。α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR)在該調節途徑中起關鍵作用[10]。黃芩苷是一種中藥，具有多種抗炎和抗凋亡的潛在生物學功能[11,12]。然而，目前尚無文獻報道黃芩苷對PE大鼠膽堿能抗炎途徑的調節作用。本文主要研究黃芩苷對PE大鼠的影響及其對膽堿能抗炎途徑的調控作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 本研究已獲得倫理委員會批準，倫理審查批件(FJ/04-IRB/C/018-V3.0)，嚴格按照實驗動物的護理和使用原則進行。70只8～10周齡雌性SD大鼠，體質量200～240 g購自上海中醫藥大學實驗動物中心。大鼠飼養溫度23～26℃，相對濕度50%～60%，上午6：00～下午18：00之間給予光照，標準飼料喂養并自由飲水。將雌性大鼠與可育的雄性大鼠交配過夜。陽性的陰道涂片確定為妊娠的第0天(gestation day 0,GD 0)。大鼠陰道分泌物涂片如圖1所示。

圖1 大鼠陰道分泌物中的精子Fig.1 Sperm in vaginal secretion of rats

1.1.2主要試劑與儀器 黃芩苷(baicalin，Bai)和LPS購自美國Sigma-Aldrich公司；膽堿能拮抗劑α-bungarotoxin購自德國merck millipore公司；TNF-α、IL-1β、IL-6的Bio-Plex Pro Rat Cytokine 8-Plex Panel Luminex試劑盒購自美國Bio-Rad公司；RNeasy mini試劑盒、Quantitect反轉錄試劑盒、QuantiFast SYBR Green PCR Kit購自德國Qiagen公司；α7nAChR的大鼠單克隆抗體、山羊抗大鼠二抗購自美國Abcam公司。分光光度計、ECL化學發光系統購自美國Thermo Scientifc公司；LightCycler480Ⅱ實時熒光定量PCR系統購自美國羅氏公司。

1.2方法

1.2.1分組與建模 70只SD大鼠隨機平均分為7組：未妊娠組(NP)、妊娠組(P)、妊娠+黃芩苷組(P+Bai)、妊娠+α-bungarotoxin組(P+α-bun)、子癇前期組(PE)、子癇前期+黃芩苷組(PE+Bai)和子癇前期+α-bungarotoxin +黃芩苷組(PE+α-bun+Bai)。參考文獻[13]所述方法，在GD 14時，將2 ml的LPS(1 mg/kg)無菌鹽水溶液通過輸液泵注入大鼠尾靜脈 (輸注速度為2 ml/h) 來誘導實驗性PE大鼠模型。GD 14～GD 19時，P+Bai組、 PE+Bai組和PE+α-bun+Bai 組大鼠腹腔注射100 mg/kg·d的黃芩苷。在黃芩苷注射前30 min分別對P+α-bun組和PE+α-bun+Bai組大鼠腹腔注射1 mg/kg·d的α-bungarotoxin。對照組大鼠在相同的時間注射等體積的生理鹽水溶液(0.9%NaCl)。

1.2.2收縮壓(systolic blood pressure,SBP)的測定 使用美國KENT公司CODA系列動物無創血壓測定系統通過容量壓力記錄法(VPR)在GD 6、11、14(LPS輸注前)、16和18(上午9：00～12：00)時測定大鼠SBP。每只大鼠進行3次測定并記錄平均值。

1.2.3尿白蛋白的測定 在GD 7、12、17和19時，將大鼠放在單獨的代謝籠中24 h以獲取尿液樣本。尿液樣品在室溫下2 000 r/min離心15 min，并將上清液保存在20℃下用于后續的蛋白質水平分析。使用全自動生化分析儀測定尿蛋白濃度。在GD 20時，將大鼠麻醉，從下腔靜脈獲取血液樣本。取出胎鼠和胎盤并稱重。所有樣品均儲存于-80℃冰箱。

1.2.4Luminex檢測 60 mg胎盤組織于600 ml RIPA裂解緩沖液中勻漿并制備裂解物。試劑盒測定細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平。根據說明書，以Luminex 200系統和Bioplex HTF進行多次測定。使用Bio-Plex Manager 5.0軟件進行數據分析，并以濃度pg/(ml·mg)表示。

1.2.5RT-qPCR 研磨胎盤組織，RNeasy mini試劑盒提取總RNA。分光光度計測定RNA濃度。Quantitect反轉錄試劑盒將RNA(500 ng)反轉錄為cDNA。QuantiFast SYBR Green PCR Kit進行RT-qPCR實驗。引物序列如下：α7nAChR 5′-CTCACAGCATGCAATCCAAGTACACTA-3′(F)，5′-CAGGACCGAAGGCTAAAAGAGCA-3′(R)。β-actin 5′-CCGGAGCTTCACCAATTGACACA-3′(F)，5′-CAGACGCAGGAGCAGTTAATCA-3′(R)。 以β-actin為內參。反應程序如下：95℃ 5 min預變性，95℃ 10 s變性，60℃ 30 s退火/延伸，40個循環。使用2-ΔΔCt方法進行數據分析。

1.2.6Western blot分析 從胎盤中提取蛋白質樣品。將樣品煮沸5 min，冰上冷卻，經12% SDS-PAGE后轉移至硝酸纖維素膜。于Tris緩沖鹽水Tween 20中用5%脫脂牛奶封閉后，以抗α7nAChR的大鼠單克隆抗體(1：500稀釋度)4℃過夜孵育。將膜在含0.05%Tween 20的PBS溶液中洗滌3次，每次5 min。將膜與辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗大鼠二抗(稀釋度為1∶3 000)于37℃孵育1 h，將膜在含0.05%Tween 20的PBS溶液中洗滌3次，每次5 min。通過ECL化學發光系統顯影。以β-actin為內參。

1.2.7免疫組織化學測定 將大鼠胎盤組織固定于中性福爾馬林，石蠟包埋并制作3 μm厚切片，將切片微波處理以進行抗原修復，并用0.3%H2O2進行預處理，隨后將切片與山羊血清和含有兔抗NF-κBp65抗體的一抗共同4℃孵育過夜。使用HRP標記的二抗37℃下孵育1 h，并用蘇木精復染，在光學顯微鏡下觀察組織。 NF-κB活化程度表示為核NF-κBp65陽性細胞占胎盤細胞總數的百分比。

2 結果

2.1黃芩苷降低了PE大鼠的SBP 如圖2所示，與NP組大鼠相比，PE組大鼠在GD 16和18時SBP顯著升高(P<0.05)。用黃芩苷治療的PE+Bai組大鼠的SBP明顯低于PE組大鼠(P<0.05)。然而，PE+α-bun+Bai組大鼠的SBP值明顯高于PE+Bai組(P<0.05)。GD 6、GD 11和GD 14時各組SBP水平差異無統計學意義。

圖2 各組大鼠的SBP變化Fig.2 SBP changes of rats in each groupNote:Compared with NP group,*.P<0.05; compared with PE group,#.P<0.05; compared with PE+Bai group,&.P<0.05.

2.2黃芩苷改善了PE大鼠的尿白蛋白水平 如圖3所示，與NP組大鼠相比，PE組大鼠在GD 17和GD 19時的平均24 h尿白蛋白水平顯著升高(P<0.05)。與PE組相比，PE+Bai組大鼠在GD 17和GD 19時的平均24 h尿白蛋白水平顯著降低(P<0.05)。與PE+Bai組相比，PE+α-bun+Bai組大鼠在GD 17和GD 19時的平均24 h尿白蛋白水平顯著升高(P<0.05)。

圖3 各組大鼠的尿白蛋白變化Fig.3 Urine albumin changes of rats in each groupNote:Compared with NP group,*.P<0.05; compared with PE group,#.P<0.05; compared with PE+Bai group,&.P<0.05.

2.3黃芩苷降低了PE大鼠胎盤中的促炎細胞因子水平 如圖4所示，與NP組大鼠相比，P+α-bun組和PE組大鼠胎盤中細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高(P<0.05)。與PE組相比，PE+Bai組大鼠胎盤中TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低(P<0.05)。與PE+Bai組相比，PE+α-bun+Bai組大鼠胎盤中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平顯著升高(P<0.05)。

圖4 各組大鼠胎盤中細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平Fig.4 Levels of cytokines TNF-α,IL-1β and IL-6 in placenta of rats in each groupNote:1.NP；2.P；3.P+Bai;4.P+α-bun;5.PE；6.PE-Bai；7.PE+α-bun+Bai；compared with NP group,*.P<0.05; compared with PE group,#.P<0.05; compared with PE+Bai group,&.P<0.05.

2.4黃芩苷增加了PE大鼠胎盤中α7nAChR表達 RT-qPCR結果顯示(圖5)，與NP組大鼠相比，PE+Bai組大鼠胎盤中α7nAChR的mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與NP組大鼠相比，PE組大鼠胎盤中α7nAChR的mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，而蛋白表達水平無顯著變化(P>0.05)。與PE組相比，PE+Bai組大鼠胎盤中α7nAChR的mRNA和蛋白表達水平升高(P<0.05)。與PE+Bai組相比，PE+α-bun+Bai組大鼠胎盤中α7nAChR的mRNA和蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。

圖5 各組大鼠胎盤中α7nAChR mRNA和蛋白的表達Fig.5 α7nAChR mRNA and protein expressions in plac-enta of each group of ratsNote:1.NP；2.P；3.P+Bai;4.P+α-bun;5.PE；6.PE-Bai；7.PE+α-bun+Bai；compared with NP group,*.P<0.05; compared with PE group,#.P<0.05; compared with PE+Bai group,&.P<0.05.

2.5黃芩苷抑制了PE大鼠胎盤中NF-κBp65的激活 如圖6所示，與NP組大鼠相比，PE組大鼠胎盤中核NF-κBp65的陽性細胞率顯著升高(P<0.05)。與PE組相比，PE+Bai組胎盤中核NF-κBp65的陽性細胞率顯著降低(P<0.05)。與PE+Bai組相比，PE+α-bun+Bai組胎盤中核NF-κBp65的陽性細胞率顯著升高(P<0.05)。

圖6 免疫組織化學染色檢測各組大鼠胎盤中NF-κBp65的表達(×400)Fig.6 Expression of NF-κBp65 in placenta of rats in each group detected by IHC staining(×400)Note:Compared with NP group,*.P<0.05; compared with PE group,#.P<0.05; compared with PE+Bai group,&.P<0.05.

3 討論

PE的癥狀包括高血壓、蛋白尿、水腫等，并且伴隨全身異常的炎癥反應，包括白細胞和內皮細胞的激活[14]。最近，一些學者集中研究了抗炎干預在PE治療中的作用。高血壓大鼠在妊娠期用抗炎細胞因子IL-10治療可使血壓和尿蛋白排泄正常化并降低IFN-g水平[15]。用MgSO4處理可顯著降低LPS誘導的PE模型大鼠的TNF-α和IL-1β水平。免疫抑制劑環孢霉素A改善了PE大鼠模型的癥狀并減弱了炎癥反應[14]。這些數據表明抗炎藥物可通過減弱炎癥反應改善PE大鼠模型的臨床癥狀。

黃芩苷是一種天然植物藥，有研究報道黃芩苷可通過改變幾種蛋白質的表達來預防嚴重的急性胰腺炎，如Bax、Bcl-2和Caspase-3，還可預防鐵過量導致的肝、腎和心臟損傷[16，17]。以上結果表明黃芩苷可以保護心臟、肝臟和腎臟免受其他疾病引起的傷害。有研究表明黃芩苷在很大程度上降低了PE動物模型的收縮壓和舒張壓癥狀，并降低尿蛋白水平[18]。黃芩苷通過抑制大鼠胎盤中的滋養層細胞凋亡并通過調節X-連鎖凋亡抑制蛋白表達和下調Caspase-9表達改善線粒體的超微結構，從而發揮治療先兆子癇的作用[19]。在本研究中LPS誘導的PE妊娠大鼠模型中，黃芩苷可有效減輕SBP和尿蛋白排泄，并可抑制胎盤中促炎細胞因子的產生。

據報道，膽堿能抗炎途徑可以抑制促炎細胞因子的過量產生[20]。越來越多的證據表明，α7nAChR在膽堿能抗炎途徑中至關重要。在人和大鼠胎盤中也觀察到了α7nAChR的表達。胎盤中內源性釋放的乙酰膽堿(ACh)與巨噬細胞上的a7AChRs結合，從而抑制細胞因子的產生[21]。用α7nAChR激動劑(如煙堿、PNU282987、GTS-21和膽堿)處理鼠巨噬細胞系可抑制促炎細胞因子[22]。本研究發現注射黃芩苷可提高胎盤中α7nAChR的mRNA和蛋白水平。同時，當用α-bungarotoxin處理PE大鼠時，黃芩苷對PE大鼠的保護作用被抵消。α7nAChR可以控制NF-κB途徑。本研究表明，黃芩苷治療可抑制PE胎盤中核NF-κBp65表達，而α-bungarotoxin則顯著拮抗這些作用；黃芩苷通過膽堿能抗炎途徑減弱LPS誘導的PE大鼠模型中的炎癥反應，從而改善PE樣癥狀的基礎。

綜上，黃芩苷通過激活α7nAChR從而激活了膽堿能抗炎性途徑，進而減少PE大鼠模型癥狀，同時抑制了胎盤的炎癥。而應用α7nAChR拮抗劑α-bungarotoxin處理則可逆轉黃芩苷的上述作用，表明激活膽堿能抗炎途徑可能有助于減輕PE，黃芩苷發揮的保護作用可能取決于其對α7nAChR的激活。