七氟醚預處理對肺移植缺血再灌注損傷大鼠的保護作用及對氧化應激指標的影響

陳文娟 薛永耐

(1.重慶市開州區人民醫院麻醉科,重慶 405400)(2.武警重慶總隊醫院麻醉科,重慶 400061)

肺移植是治療終末期肺疾病的有效手段,缺血再灌注損傷(Ischemia-reperfusion injury,IRI)是肺移植術后常見的并發癥,是導致患者死亡的重要原因之一[1]。IRI是指組織器官缺血恢復血流后,不僅組織器官功能未恢復,反而使缺血引起的功能、代謝障礙和結構破壞進一步加重,甚至出現不可逆情況。目前為止,IRI的發病機制尚未明了,可能與免疫炎癥、氧化應激損傷、細胞凋亡和基因等因素有關[2]。氧化應激在IRI中的作用是近年來研究的熱點。氧化應激可以通過脂質過氧化、蛋白質變性、線粒體途徑、內質網或死亡受體途徑等介導組織損傷[3]。七氟醚是臨床上常用的吸入性麻醉藥物,有研究顯示,七氟醚預處理可以緩解某些器官的IRI和移植后排斥反應,如肝臟和腎臟等[4-6]。七氟醚對IRI的保護作用與改善氧化應激損傷密切相關[7]。七氟醚預處理是否能緩解肺移植后 IRI,既往報道較少。Yamada等[8]發現,七氟醚預處理可以改善肺移植后原發性移植物功能障礙和急性排斥反應,并且明顯下調肺組織和血漿中白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)水平,提示七氟醚可能對肺移植后IRI有一定保護作用。本研究建立大鼠左肺原位移植模型,從凋亡和自噬兩方面探討七氟醚預處理對IRI的保護作用,及對肺組織和血清中氧化應激指標的影響,旨在為七氟醚在肺移植中的臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

30只雄性SD大鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,實驗動物生產許可證號為 SCXK(京)2006-2009。動物飼養環境為溫度(22±2)℃、相對濕度(50±10)%、明暗周期12 h/12 h,自由攝食和飲水。其中12只大鼠作為肺臟提供用鼠(6只的肺臟提供給B組,6只的肺臟提供給C組),剩余18只大鼠依據隨機數字的方法分為A組(僅開胸,不做肺部移植)、B組(肺部移植)和C組(七氟醚預處理+肺部移植),每組均為6只。

1.2 試劑

戊巴比妥鈉(上海斯信生物科技有限公司),低鉀右旋糖酐溶液(北京普博斯生物科技有限公司),七氟醚(日本Maruishi公司),HE染色試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司),碘化丙啶PI染色液(美國 Sigma公司),免疫組化 SP試劑盒(美國Inventrigen公司),兔抗 LC3-Ⅱ抗體和兔抗 LC3-Ⅰ抗體(美國Sigma公司),ELISA試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)。

1.3 原位左肺移植及七氟醚預處理

1.3.1 肺臟提供用鼠的左肺摘除:將計劃提供C組肺臟的6只大鼠置于自制密閉麻醉箱(20 cm×12 cm×10 cm)中,暴露于1.5%七氟醚和50%氧氣中,持續30 min[8];將計劃提供B組的6只大鼠暴露于50%氧氣中30 m in。之后將全部大鼠進行腹腔1%戊巴比妥(40 mg/kg體質量)注射,完成麻醉。固定大鼠后切開氣管,連接呼吸機(型號R415,深圳瑞沃德生命科技有限公司生產;頻率70次/min,潮氣量10 mL/kg)。將左側胸腔切開,游離左肺動脈、肺靜脈和支氣管。自右心室流出道插入導管至左肺動脈開口,低壓灌注15 mL低鉀右旋糖酐溶液,灌注完畢后,將供肺取出進行套管,順序為肺動脈、肺靜脈、支氣管。用無菌注射器洗凈支氣管中的液體,然后充氣使其處于半膨脹狀態,隨后用動脈夾夾住。用濕紗布包裹供肺,放入4℃的低鉀右旋糖酐溶液中保存。供肺熱缺血時間為2～3 min,總缺血時間為1 h左右。

1.3.2 B組與C組大鼠的左肺移植:B組與C組大鼠麻醉和氣管插管過程與肺臟提供大鼠相同。將大鼠開胸后暴露肺門,向近心端和遠心端游離支氣管、肺動脈和肺靜脈。從支氣管和肺靜脈間穿入2根7號絲線,把左肺向外牽拉,于近心端先結扎支氣管和肺動脈,隨后結扎肺靜脈。從遠心端切除左側肺臟并帶出肺門結構。用連續外翻褥式縫合法吻合支氣管膜部、肺動脈和肺靜脈,進行左肺原位移植[9]。A組大鼠僅作開胸。本研究所有大鼠術后均存活。

移植成功的標準為:肺部充氣和彈性回縮良好,呈粉紅色,血管吻合口未見滲血,并且氣管無漏氣[10]。等待移植肺完全擴張后,用無菌棉簽將其回納入胸腔,給予持續2 cm H2O的呼氣末正壓,以防止肺不張。再灌注后2 h放血處死 A、B、C組的全部大鼠,收集全部大鼠的股動脈血,收集A組大鼠的左肺以及B組、C組大鼠的移植肺。

1.4 觀察指標

1.4.1 動脈血氣分析:用ABL90 FLEX血氣分析儀(上海生科儀器有限公司)分析動脈血氧合指數(PaO2/FiO2)、肺內分流率(Qs/Qt)。取上1/3肺組織,用濾紙吸干表面液體,稱取濕質量。隨后置入80℃烤箱中,48 h后稱干質量,計算肺濕干比。

1.4.2 移植肺組織病理學觀察:將中間1/3肺組織置于甲醛溶液中固定,用石蠟包埋,切片,隨后進行HE染色。用CX43顯微鏡(日本奧林巴斯公司)觀察肺泡出血、水腫等情況。根據肺泡觀察結果進行評分:1分為無損傷;2分為損傷25%;3分為損傷50%;4分為損傷75%;5分為彌漫性損傷[11]。

1.4.3 碘化丙啶染色觀察肺組織細胞凋亡:取肺組織切片,脫蠟、水化,抗原修復后用BSA封閉。用碘化丙啶(PI,紅色,50μg/mL)及 4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI,藍色,50μg/mL)染色 5 min,甘油封片后顯微鏡下觀察。PI標記凋亡細胞,DAPI標記細胞核。

1.4.4 免疫組化SP法檢測自噬蛋白Beclin-1水平:取肺組織切片,脫蠟、水化,抗原修復后用 BSA封閉。滴加一抗,4℃孵育過夜,PBS洗去抗體,隨后加入二抗,溫室孵育 15 min,加入 SP液 37℃15 m in,進行 DAB顯色,細胞質有藍顆粒沉著為陽性。

1.4.5 Western-blot檢測自噬蛋白 LC3-Ⅱ和 LC3-Ⅰ表達水平:取下1/3肺進行組織勻漿,加入蛋白裂解液,冰上裂解 25 min后,15 000轉/m in離心15 min,將上清液轉移至EP管中。樣品中加入SDS緩沖液煮沸5 min使蛋白變性。SDS-PAGE電泳后將蛋白轉移至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉封閉1 h,逐次孵育一抗和二抗。ECL顯色,以GAPDH作為內參,計算目的蛋白條帶與GAPDH灰度比值。

1.4.6 ELISA檢測肺組織和血清氧化應激相關蛋白水平:用ELISA法檢測肺組織勻漿液和血清中超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平。實驗步驟嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.5 統計方法

采用SPSS 20.0進行數據分析。呈正態分布計量數據用(±s)表示,3組呈正態分布計量數據間的比較采用單因素方差分析,兩兩比較用SNK-q法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組血氣分析及肺組織濕干比的比較

3組的 PaO2/FiO2、Qs/Qt、肺濕干比數據差異均具有統計學意義(F=23.335,21.056,17.756,P＜0.05),PaO2/FiO2的數值為A組高于C組,C組高于B組(P＜0.05),Qs/Qt、肺濕干比的數值均為B組高于 C組,C組高于A組(P＜0.05),見表1。

表1 3組血氣分析及肺組織濕干比的比較(±s)Table 1 Comparison of blood gas analysis and lung tissue wet-dry ratio between the three groups(±s)

表1 3組血氣分析及肺組織濕干比的比較(±s)Table 1 Comparison of blood gas analysis and lung tissue wet-dry ratio between the three groups(±s)

注:與 A組比較,aP＜0.05;與 B組比較,bP＜0.05;與 C組比較,cP＜0.05Note:Compare with group A,aP＜0.05;Compare with group B,bP＜0.05;Compare with group C,cP＜0.05

組別 n PaO2/FiO2 Qs/Qt 肺濕干比A 組 6 408.32±28.36bc 8.01±0.62bc 4.12±0.28bcB 組 6 289.33±36.01ac 26.38±1.05ac 5.58±0.36acC 組 6 360.01±30.01ab 14.33±0.96ab 4.90±0.41ab

2.2 3組肺組織病理學變化及評分的比較

3組的HE染色肺病理損傷評分數據差異均具有統計學意義(F=15.323,P＜0.05),HE染色肺病理損傷評分為B組高于C組,C組高于 A組(P＜0.05),見表 2和圖 1。

表2 3組HE染色肺病理損傷評分(±s,分)Table 2 Pulmonary injury scores with HE staining in the three groups(±s,score)

表2 3組HE染色肺病理損傷評分(±s,分)Table 2 Pulmonary injury scores with HE staining in the three groups(±s,score)

注:與 A組比較,aP＜0.05;與 B組比較,bP＜0.05;與 C組比較,cP＜0.05Note:Compare with group A,aP＜0.05;Compare with group B,bP＜0.05;Compare with group C,cP＜0.05

組別 n 分值A 組 6 0.00±0.00bcB 組 6 4.86±0.12acC 組 6 3.67±0.20ab

圖1 3組肺組織HE染色(×200)注:a:A組大鼠肺泡結構清晰,肺泡壁薄且完整,未見出血或水腫;b:B組大鼠肺泡結構破壞,部分肺泡代償性肺氣腫,肺泡內有滲出物,肺泡隔增厚,鏡下可見大量炎細胞浸潤;c:C組大鼠組織損傷比B組輕,肺泡隔較薄,炎細胞浸潤也較少Fig.1 HE staining of lung tissue in three groups(×200)Note:a:rats in group A had clear alveolar structure,thin and complete alveolar walls,and no bleeding or edema was observed;b:the alveolar structure of rats in group B was damaged,partial alveolar compensatory emphysema was found,exudate was found inalveoli,alveolar septum was thickened,and a large number of inflammatory cells were seen under the microscope;c:rats in groupC suffered less tissue damage than those in group B,with thinner alveolar septum and less inflammatory cell infiltration

2.3 3組肺組織凋亡情況的比較

3組的肺組織細胞凋亡率數據差異均具有統計學意義(F=18.866,P＜0.05),肺組織細胞凋亡率為B組高于C組,C組高于 A組(P＜0.05),見圖2和表3。

圖2 PI染色觀察肺組織細胞凋亡率(×200)注:a:A組大鼠;b:B組大鼠;c:C組大鼠;凋亡細胞染為紅色,細胞核染為藍色Fig.2 The apoptosis rate of lung tissue was observed by PI staining(×200)Note:a:rats in group A;b:rats in group B;c:rats in group C;The apoptotic cells were stained red and the nuclei were stained blue

表3 3組肺組織凋亡情況的比較(±s,%)Table 3 Comparison of lung tissue apoptosis in the three groups(±s,%)

表3 3組肺組織凋亡情況的比較(±s,%)Table 3 Comparison of lung tissue apoptosis in the three groups(±s,%)

注:與 A組比較,aP＜0.05;與 B組比較,bP＜0.05;與 C組比較,cP＜0.05Note:Compare with group A,aP＜0.05;Compare with group B,bP＜0.05;Compare with group C,cP＜0.05

組別 n 凋亡率A 組 6 4.12±0.09bcB 組 6 13.36±1.25acC 組 6 9.32±0.15ab

2.4 3組肺組織自噬情況的比較

3組的 Beclin-1陽性細胞數、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ數據差異均具有統計學意義(F=20.007,19.531,P＜0.05),Beclin-1 陽性細胞數、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的數值均為A組高于C組,C組高于B組(P＜0.05),見圖 3、圖 4和表 4。

圖3 肺組織Beclin-1陽性免疫組化圖(×200)注:a:A組大鼠;b:B組大鼠;c:C組大鼠Fig.3 Immunohistochemicalmap of beclin-1 positive lung tissue(×200)Note:a:rats in group A;b:rats in group B;c:rats in group C

圖4 Western-blot檢測LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ蛋白表達水平Fig.4 Western b lot detection LC3-Ⅰand LC3-Ⅱprotein expression levels

表4 3組肺組織自噬情況的比較(±s)Table 4 Com parison of au tophagy of lung tissue in the three groups(±s)

表4 3組肺組織自噬情況的比較(±s)Table 4 Com parison of au tophagy of lung tissue in the three groups(±s)

注:與 A組比較,aP＜0.05;與 B組比較,bP＜0.05;與 C組比較,cP＜0.05Note:Compare with group A,aP＜0.05;Compare with group B,bP＜0.05;Compare with group C,cP＜0.05

組別 n Beclin-1陽性細胞數 LC3-Ⅱ/LC3-ⅠA 組 6 963.21±102.01bc 0.21±0.05bcB 組 6 320.01±63.25ac 0.09±0.01acC 組 6 806.21±103.88ab 0.18±0.08ab

2.5 3組肺組織勻漿液中氧化應激指標水平的比較

3組肺組織勻漿液中的 SOD、GSH-Px、CAT、ROS、MDA數據差異均具有統計學意義(F=15.336、22.253、14.536、15.097、25.337,P＜0.05),SOD、GSH-Px、CAT的數值為 A組高于 C組,C組高于B組(P＜0.05),ROS、MDA的數值均為B組高于C組,C組高于A組(P＜0.05),見表5。

表5 3組肺組織勻漿液中氧化應激指標水平的比較(±s)Table 5 Com parison of oxidative stress index levels in lung tissue homogenate between three groups(±s)

表5 3組肺組織勻漿液中氧化應激指標水平的比較(±s)Table 5 Com parison of oxidative stress index levels in lung tissue homogenate between three groups(±s)

注:與 A組比較,aP＜0.05;與 B組比較,bP＜0.05;與C組比較,cP＜0.05Note:Compare with group A,aP＜0.05;Compare with group B,bP＜0.05;Compare with group C,cP＜0.05

組別 n SOD/(U/mL) GSH-Px/(μmol/L) CAT/(U/mL) ROS/(U/mL) MDA/(nmol/L)A 組 6 16.12±1.01bc 26.20±2.69bc 22.33±4.85bc 15.26±2.87bc 22.68±3.63bcB 組 6 11.01±3.62ac 10.32±2.10ac 16.36±1.11ac 19.32±3.02ac 26.23±2.34acC 組 6 15.13±2.27ab 24.30±1.90ab 19.82±2.96ab 17.33±1.00ab 23.05±1.17ab

2.6 3組血清中氧化應激指標水平的比較

3 組血清中的 SOD、GSH-Px、CAT、ROS、MDA 數據差異均具有統計學意義(F=27.693、31.025、17.753、18.357、20.367,P＜0.05),SOD、GSH-Px、CAT的數值為 A組高于 C組,C組高于 B組(P＜0.05),ROS、MDA的數值均為B組高于C組,C組高于 A組(P＜0.05),見表6。

表6 3組血清中氧化應激指標水平的比較(±s)Table 6 Comparison of serum Levels of oxidative stress in three groups(±s)

表6 3組血清中氧化應激指標水平的比較(±s)Table 6 Comparison of serum Levels of oxidative stress in three groups(±s)

注:與 A組比較,aP＜0.05;與 B組比較,bP＜0.05;與C組比較,cP＜0.05Note:Compare with group A,aP＜0.05;Compare with group B,bP＜0.05;Compare with group C,cP＜0.05

組別 n SOD/(U/mL) GSH-Px/(μmol/L) CAT/(U/mL) ROS/(U/mL) MDA/(nmol/L)A 組 6 6.05±0.32bc 13.25±1.01bc 12.42±0.34bc 4.13±0.20bc 3.69±0.51bcB 組 6 4.03±0.20 ac 7.32±1.01acC 組 6 5.14±0.61ab 12.63±0.85ab 9.01±0.10ab 6.20±0.69ab 4.11±0.17abac 11.36±1.20ac 8.32±0.89ac 8.47±0.35

3 討論

IRI是一個極為復雜的過程,與免疫炎癥、氧化應激損傷、細胞凋亡和細胞自噬等密切相關[2,12]。IRI導致的肺損傷一直是肺移植后早期發病和死亡的重要原因之一。嚴重的IRI會增加急性排斥反應和移植后阻塞性支氣管炎的風險,并且導致遠期移植物的功能障礙[13]。本研究發現七氟醚預處理可以明顯改善PaO2/FiO2和Qs/Qt,緩解肺病理損傷,提示七氟醚預處理對肺移植IRI有一定保護作用。

七氟醚是臨床上常用的吸入性麻醉藥物,除了具有良好的麻醉效應外,還能明顯改善多種器官的IRI,如心肌、大腦、肺、腎、肝[4-5]。七氟醚對 IRI的保護作用可能與改善免疫炎癥和氧化應激損傷、調控micro-RNA表達、調節細胞凋亡和自噬等有關[14-15]。本研究從凋亡和自噬兩方面探討七氟醚對肺移植后IRI的保護作用。細胞凋亡是細胞死亡的形式之一,以核固縮、胞膜發泡和凋亡小體形成為特征,是維持機體自身穩定的一種重要機制。IRI細胞凋亡的發生機制尚未闡明,可能與氧自由基、鈣超載、細胞因子、線粒體等有關[16]。自噬在 IRI中的作用越來越受到重視,在缺血階段,自噬發揮保護細胞的作用,而在再灌注階段,自噬可能會加重細胞損傷甚至導致細胞死亡[17]。Liu等[18]建立了大鼠原位肺移植模型,并采用自噬抑制劑(3-甲基腺嘌呤)進行干預,結果證實自噬在肺移植IRI中有重要作用。本研究發現,七氟醚預處理可以改善移植肺組織的凋亡和自噬。在心肌細胞缺氧/復氧(H/R)損傷的研究中,Lu等[19]同樣發現七氟醚預處理可以改善H/R誘導的心肌細胞凋亡和自噬,并且抑制Beclin-1/PI3KC3復合物的形成。

IRI可引起器官氧化應激損傷。研究發現,肺移植IRI可以使肺組織和血清ROS和MDA水平升高,SOD、GSH-Px和 CAT水平降低。七氟醚改善IRI誘導的氧化應激損傷已有報道。與本研究結果類似的是,有研究發現七氟醚可以明顯緩解IRI時心肌組織SOD、GSH和MDA水平。有趣的是,氧化應激損傷與凋亡和自噬有關。氧化應激可通過線粒體、死亡受體、內質網應激等途徑介導細胞凋亡和自噬[20]?？梢酝茰y,七氟醚可能通過抗氧化應激損傷改善凋亡和自噬,進而發揮肺移植IRI保護作用。

本研究的局限性為:(1)僅檢測了七氟醚預處理對氧化應激指標水平的影響,未進行深入的機制研究;(2)本研究只分析肺移植前七氟醚預處理對大鼠的影響,未分析后處理或預處理聯合后處理對大鼠的影響。

綜上所述,通過建立大鼠左肺原位移植再灌注肺部損傷模型,證實七氟醚預處理可以通過抗凋亡和自噬對肺移植IRI起到保護作用,七氟醚還可以改善移植肺組織和外周血清中氧化應激指標的水平。由于七氟醚是臨床常用的吸入性麻醉藥物,也為臨床預防IRI提供了思路,未來需要進一步深入研究。