血清miR-224-5p在胰腺導管腺癌中的表達及其對臨床診斷的意義

賈孝娟 張巍巍 李文利 姜大磊 謝方瑜 張一 付來琳 王堯 陳斌 宋敏 李靜 解祥軍

1青島大學附屬青島市市立醫院消化內科，青島 266011；2青島大學附屬青島市市立醫院心內科，青島 266011；3青島大學附屬青島市市立醫院肝膽外科，青島 266011；4青島大學附屬青島市市立醫院內窺鏡室，青島 266011

PDAC是胰腺癌中最常見的亞型，占所有胰腺腫瘤的85%[1]。由于胰腺位置隱匿，早期癥狀不典型[2]，近80%的患者在確診前就已發生局部浸潤或遠處轉移，因此識別潛在敏感的生物標志物對PDAC早期診斷至關重要。研究發現，PDAC患者血清中存在miRNAs表達譜的異常，且比蛋白質標志物出現得更早，提示循環miRNAs可能對PDAC的早期診斷具有重要意義[3-4]。miR-224-5p(miR-224)是miRNAs家族的一員，可作為結直腸癌、肝細胞癌等診斷的替代和無創生物標志物之一[5-6]。文獻報道[7-9]，PDAC組織的miR-224-5p異常高表達，且常出現于PDAC的早期。本研究檢測PDAC患者血清miR-224-5p表達，探討其對胰腺癌早期臨床診斷的價值。

資料與方法

一、一般資料

收集青島市市立醫院2018年8月至2020年4月間收治的40例PDAC患者。其中男性25例，女性15例，年齡(64±9)歲。按第8版AJCC分期將患者分為早期PDAC組(11例)和中晚期PDAC組(29例)。納入標準：臨床病理資料完整；EUS-FNA或手術切除術后組織及細胞病理檢查確診為PDAC。排除標準：慢性胰腺炎及PDAC癌前病變；有其他惡性腫瘤病史；伴有急性感染、肝炎、冠心病、腦梗死等嚴重疾??；采集血樣前患者接受過手術、化放療、介入等其他治療。

收集同期21例慢性胰腺炎患者作為胰腺良性疾病對照組，其中男性10例，女性11例，年齡(61±8)歲。招募體檢的40名健康志愿者作為健康對照組(無肝膽或胰腺疾病史、無其他系統疾病、無惡性疾病)，其中男性19例，女性21例，年齡(61±7)歲。慢性胰腺炎患者及健康對照者與PDAC患者在年齡、性別等方面具有可比性，差異無統計學意義。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

二、方法

所有入組對象抽血前3 d限制脂肪、蛋白等飲食，采集外周靜脈血3 ml，離心后取上清液，移入2 ml無RNA酶的EP管中，置于-80℃冰箱保存備用。

采用Trizol試劑(北京天根生化科技有限公司)提取血清總RNA，紫外分光光度法測定樣本總RNA的濃度和純度，A260/280在1.8～2.1之間。應用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(廣州復能基因有限公司，QP013)行逆轉錄反應生成 cDNA。采用定量PCR試劑Green Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa公司，RR820A)配制反應混合液。然后把加好樣品的96孔板放在ABI 7500型熒光定量PCR儀中進行qPCR反應。miR-224-5p正向引物序列為5′-TCAAGTCACTAGTGGTTCCGTTTAG-3′，反向引物序列為5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；內參U6正向引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。PCR反應條件：95 ℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 34 s，共循環40次。由儀器自帶軟件獲取樣本Ct值，按照公式2-△△Ct計算miR-224-5p相對表達量，每個樣品設3個復管，取均值。

CA19-9檢測試劑購自上海羅氏診斷產品有限公司，上全自動化學發光免疫分析儀(Roche)cobas 8000檢測。

三、統計學處理

結 果

一、PDAC組與慢性胰腺炎組及健康對照組血清miR-224-5p水平比較

早期PDAC組、中晚期PDAC組、慢性胰腺炎組和健康對照組血清miR-224-5p水平分別為3.21(2.01，4.60)、4.70(3.50，8.26)、1.72(1.02，2.78)、1.38(0.89，2.11)，中晚期PDAC組血清miR-224-5p水平顯著高于早期PDAC組，早期PDAC組又顯著高于慢性胰腺炎組和健康對照組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，而慢性胰腺炎組與健康對照組的差異無統計學意義。

二、miR-224-5p、CA19-9診斷PDAC的臨床價值

血清miR-224-5p、CA19-9診斷PDAC及早期PDAC的靈敏度、特異度的差異均無統計學意義。miR-224-5p聯合CA19-9診斷PDAC的總靈敏度為92.5%～95.0%，高于CA19-9(P值分別為0.037、0.046)，對早期PDAC的診斷靈敏度為90.0%～90.9%，略低于總靈敏度，但高于單CA19-9(P值分別為0.044、0.041)及miR-224-5p(P值分別為0.038、0.023)；特異度為71.4%～72.5%，差異無統計學意義。從高到低，3者對PDAC及早期PDAC的診斷靈敏度依次為miR-224-5p+CA19-9、miR-224-5p、CA19-9，特異度依次為CA19-9、miR-224-5p、miR-224-5p+CA19-9(表1、圖1)。

表1 miR-224-5p、CA19-9診斷胰腺導管腺癌的受試者工作特征曲線分析

圖1 miR-224-5p、CA19-9診斷PDAC、早期PDAC的受試者工作特征曲線。1A PDAC組比健康對照組；1B PDAC組比慢性胰腺炎組；1C 早期PDAC組比健康對照組；1D 早期PDAC組比慢性胰腺炎組

三、PDAC患者血清miR-224-5p水平與腫瘤臨床病理參數的關系

PDAC患者血清miR-224-5p表達水平與患者年齡、性別、腫瘤位置及大小無顯著相關性(P值均>0.05)，而與TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移相關(表2)。

討 論

PDAC侵襲性高、進展性快，預后極差。目前診斷PDAC較為可靠的循環標志物為血清CA19-9[10]，但其靈敏度60%～90%，特異度68%～ 91%，假陰性及假陽性率較高，作為早期檢測標志物的價值有限[11]。microRNAs是一類由19～23個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，參與細胞增殖、蛋白質代謝和腫瘤發展等生理和病理過程[12]。它們具有高度保守性、特殊穩定性和組織特異性，易于在體液中獲得。文獻報道，miR-224-5p是一種致癌miRNA，在胃癌[13]、結直腸癌[14]、肝癌[15]、食管鱗癌[16]等消化系統腫瘤的表達明顯高于非腫瘤組織。Mazza等[17]、Vila-Navarro等[18]報道PDAC高表達miR-224-5p。高侵襲性和轉移性PDAC組織的miR-224-5p表達顯著增高[7-8]。miR-224-5p可通過直接靶向下調PDAC細胞表面CD40蛋白表達，增強PDAC的侵襲和轉移[7]；通過抑制PDAC細胞Aspc-1和BxPC3的生長、侵襲和遷移，增加細胞早期凋亡[8]；通過直接與其3′-非翻譯區結合而逆向調節相互作用蛋白TXNIP，激活誘導因子HIF1α，從而促進PDAC的惡性進展[19]。近來研究還發現，miR-224-5p可靶向抑制前蛋白轉化酶PCSK9誘導胰腺癌細胞BON-1凋亡[20]，miR-224-5p作為區室特異性調節劑，在PDAC細胞基質中及癌癥相關的成纖維細胞中過表達，從而誘導了激活的表型、促進腫瘤的進展[9]。上述研究表明miR-224-5p參與了PDAC的發生和發展，且有望通過靶向相關基因和途徑成為PDAC潛在的治療靶點[21]。

表2 胰腺導管腺癌患者血清miR-224-5p水平與臨床病理特征的關系

本研究結果顯示，PDAC患者血清miR-224-5p水平較慢性胰腺炎患者及健康對照者顯著上調，且診斷靈敏度高于CA19-9，可作為PDAC診斷的循環生物標志物。通過進一步評估對早期PDAC診斷價值，結果顯示兩者聯合檢測的診斷靈敏度高于單獨CA19-9或miR-224-5p，特異度與單獨miR-224-5p或CA19-9檢測相似，提示miR-224-5p聯合CA19-9檢測對早期PDAC診斷有較高的臨床應用價值。

本研究結果還顯示，PDAC患者血清miR-224-5p水平與腫瘤TNM分期、淋巴轉移和遠處轉移呈正相關(P值均<0.05)，提示血清miR-224-5p可能在PDAC細胞的增殖和遷移中起重要作用。

綜上所述，miR-224-5p在PDAC患者尤其是在早期PDAC患者血清水平明顯上調，miR-224-5p或聯合CA19-9診斷價值優于單獨CA19-9檢測，且血清樣本容易獲取，因此miR-224-5p可能作為PDAC早期診斷的一項敏感的循環生物標志物。本研究不足之處為樣本量較小，需要擴大樣本量進一步驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突