CD3/KIF20A雙特異性抗體介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞對(duì)KIF20A陽(yáng)性胰腺癌PANC1細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)

賈原 張俊萍 薛昭君 楊曉玲 馮慧晶 劉鵬敏

山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院山西大醫(yī)院腫瘤中心，太原 030032

腫瘤免疫治療是一類(lèi)以CD3+T淋巴細(xì)胞為主輸注的治療方法，因其不良反應(yīng)小、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，被公認(rèn)為是治療胰腺癌的有效途徑之一[1]。針對(duì)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(簡(jiǎn)稱(chēng)T細(xì)胞)的胰腺腫瘤抗原的篩選及鑒定成為學(xué)術(shù)界關(guān)注的熱點(diǎn)[1-3]，而針對(duì)誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞的腫瘤抗原的篩選及鑒定也受到學(xué)術(shù)界廣泛的關(guān)注[3]。驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員20A(kinesin family menber 20A, KIF20A)作為一種腫瘤相關(guān)抗原，在胰腺癌細(xì)胞高表達(dá)而在正常細(xì)胞中不表達(dá)(或低表達(dá))[4-6]，由此在胰腺癌的免疫治療中具有很大的開(kāi)發(fā)潛力[3]。有研究[7]將KIF20A與CD3單克隆抗體重組成雙特異性抗體，通過(guò)同時(shí)識(shí)別KIF20A和CD3兩個(gè)分子標(biāo)靶，定向趨化遷移CD3+T細(xì)胞至KIF20A+腫瘤細(xì)胞，加強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。此外，通過(guò)靶向同一種細(xì)胞上的兩種不同受體，雙特異性抗體可以誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)的改變，包括癌癥擴(kuò)散信號(hào)或者炎癥信號(hào)[8]。本課題組前期應(yīng)用維生素C干預(yù)樹(shù)突樣細(xì)胞(dendritic cell, DC)-T細(xì)胞(DC-T細(xì)胞)[9-10]，本研究制備靶向KIF20A及CD3的雙特異性抗體(CD3/KIF20A雙抗)，并將其裝載于維生素C干預(yù)的DC-T細(xì)胞，觀察其對(duì)KIF20A+胰腺癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。

材料與方法

一、細(xì)胞系及主要試劑

胰腺癌細(xì)胞系PANC1購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)集存庫(kù)(American type culture collection，ATCC)，常規(guī)培養(yǎng)復(fù)蘇。鼠抗人CD3單抗、 KIF20A單抗購(gòu)自美國(guó)TaKaRa公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)羅氏公司；CD3標(biāo)記單抗、FITC標(biāo)記CD28單抗、PE標(biāo)記CD8單抗均購(gòu)自美國(guó)BD公司；Traut′s試劑、 4-(N- 馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷 -1- 羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(SULFO-SMCC)購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

二、CD3/KIF20A雙抗的制備及純化鑒定

取1 mg人源CD3單抗溶于500 μl 0.5 mmol/L交聯(lián)劑Traut′s試劑[11]，室溫作用2 h，上Sephrose-G25凝膠層析柱，應(yīng)用含20 mmol/L Tris、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L DTT的洗脫液(pH 7.2)洗去多余的Traut′s試劑，獲取人源CD3單鏈抗體；取1 mg人源KIF20A單抗，溶于500 μl 0.5 mmol/L交聯(lián)劑Sulfo-SMCC，室溫作用2 h，上Sephrose-G25凝膠層析柱，應(yīng)用含20 mmol/L Tris、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L DTT的洗脫液(pH 7.2)洗去多余的Sulfo-SMCC，獲取人源KIF20A單鏈抗體；將上述CD3、KIF20A單鏈抗體混合，裝入能透過(guò)分子質(zhì)量<10 000的透析袋，置4℃透析18 h，平衡液為20 mmol/L Tris、100 mmol/L NaCl(pH7.2)。透析后在室溫下上Sephrose-G25凝膠層析柱，應(yīng)用平衡液洗脫，收集CD3/KIF20A雙抗，再重復(fù)上凝膠層析柱過(guò)濾1次，收集純化的雙抗，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳鑒定后超濾濃縮，獲得人源CD3/KIF20A雙特異性抗體。

三、DC-T細(xì)胞培養(yǎng)及分組

抽取健康志愿者外周血20 ml，采用淋巴細(xì)胞分離液，以1 900～2 300r/min(離心半徑15 cm)離心10～20 min分離出單核細(xì)胞層。吸取單核細(xì)胞，加30～50 ml淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜。次日將懸浮的細(xì)胞倒入另一個(gè)無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶用于培養(yǎng)T細(xì)胞，培養(yǎng)液中加入CD3單抗、1 000 U/ml IL-2，培養(yǎng)3～5 d；貼壁的細(xì)胞用于培養(yǎng)DC細(xì)胞，培養(yǎng)液中加或不加入1 mmol/L維生素C，培養(yǎng)3～5 d，分別獲取維生素C干預(yù)的DC(vcDC)或DC。再將vcDC、DC分別與T細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)5～9 d，分別獲取vcDC-T細(xì)胞及DC-T細(xì)胞。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組T細(xì)胞亞群及培養(yǎng)上清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-12水平。

四、CD3/KIF20A雙抗裝載的T細(xì)胞殺傷PANC1細(xì)胞的毒性試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PANC1(KIF20A+)作為靶細(xì)胞，以5 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)過(guò)夜；將10、50、100、300 ng雙抗分別和1×105個(gè)T細(xì)胞混合作為效應(yīng)細(xì)胞，以效靶細(xì)胞20∶1比例共同培養(yǎng)2、6、10 h，倒置顯微鏡下觀察效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的聚集效應(yīng)，并應(yīng)用乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞殺傷率，即在培養(yǎng)到時(shí)間點(diǎn)后用50 μl/孔的冷1640培養(yǎng)液中止反應(yīng)，1 500 r /min(離心半徑15 cm)離心5 min，收集上清，每孔加入100 μl LDH，室溫避光孵育30 min后每孔加1 mol/L HCl 50 μl終止酶促反應(yīng)，去除孔中含有的氣泡，1 h內(nèi)上酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔波長(zhǎng)490 nm處的吸光度值(A490值)，取3孔均值，計(jì)算T細(xì)胞對(duì)PANC1細(xì)胞的殺傷率，明確殺傷率最高的雙抗裝載劑量。細(xì)胞殺傷率(%)=[(實(shí)驗(yàn)組A490值-效應(yīng)細(xì)胞A490值-靶細(xì)胞A490值)/(靶細(xì)胞最大A490值-靶細(xì)胞A490值) ]×100%。

然后以PANC1(KIF20A+)為靶細(xì)胞，以5 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)過(guò)夜，以效靶細(xì)胞20∶1的比例分別加入DC-T細(xì)胞或裝載對(duì)PANC1細(xì)胞殺傷率最高的雙抗劑量的DC-T細(xì)胞及vcDC-T細(xì)胞，分別共同培養(yǎng)2、4、6、8、10、12 h，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。同樣應(yīng)用LDH法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞殺傷率。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、化學(xué)交聯(lián)CD3/KIF20A雙抗的鑒定

經(jīng)透析及2次Sepharose-G25柱過(guò)濾，通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳分離得到單一的CD3/KIF20A特異性雙抗體蛋白條帶，分子質(zhì)量為130 000，雙抗的產(chǎn)率約50%。

圖1 各抗體的SDS-PAGE凝膠電泳圖 1 分子量標(biāo)記；2 CD3單抗；3 KIF20A單抗；4 透析后的CD3/KIF20A雙抗；5 第1次G25柱過(guò)濾后的CD3/KIF20A雙抗；6 第2次G25柱過(guò)濾后的CD3/KIF20A雙抗； 7 濃縮后的CD3/KIF20A雙抗

二、T細(xì)胞、DC-T細(xì)胞、vcDC-T細(xì)胞的亞群比例及細(xì)胞因子分泌水平

vcDC-T細(xì)胞組的CD8+CD28+及CD40L細(xì)胞亞群比例顯著高于DC-T細(xì)胞組及T細(xì)胞組，而負(fù)性調(diào)節(jié)的Treg細(xì)胞亞群比例顯著低于DC-T細(xì)胞組及T細(xì)胞組；IL-2、IFN-γ、IL-12的分泌量顯著高于DC-T細(xì)胞組及T細(xì)胞組，而IL-4分泌量顯著低于DC-T細(xì)胞組及T細(xì)胞組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表1)，說(shuō)明維生素C干預(yù)不僅可以有效提升T細(xì)胞的功能，還可將過(guò)繼免疫反應(yīng)與天然免疫效應(yīng)相結(jié)合。

三、T細(xì)胞、DC-T細(xì)胞、雙抗DC-T細(xì)胞的靶向效應(yīng)及對(duì)PANC1細(xì)胞的殺傷率

100 ng CD3/KIF20A雙抗裝載的DC-T細(xì)胞對(duì)KIF20A+胰腺癌PANC1細(xì)胞有明顯的靶向性，顯著地趨向PANC1相對(duì)集中的區(qū)域(圖2)。

10、50、100、300 ng雙抗裝載的1×105個(gè)T細(xì)胞與PANC1細(xì)胞(20∶1)共培養(yǎng)2、6、10 h后對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷率見(jiàn)圖3，以裝載100 ng雙抗劑量的T細(xì)胞殺傷能力最強(qiáng)，裝載率為1 000個(gè)細(xì)胞裝載1 ng雙抗。

表1 T細(xì)胞、DC-T細(xì)胞、vcDC-T細(xì)胞的亞群比例及細(xì)胞因子分泌水平

圖2 PANC1細(xì)胞(2A)及DC-T細(xì)胞(2B)、100 ng CD3/KIF20A雙抗裝載的DC-T細(xì)胞(2C)對(duì)PANC1細(xì)胞的靶向聚集(×100)

圖3 裝載不同劑量雙抗的T細(xì)胞對(duì)PANC1細(xì)胞的殺傷率

DC-T細(xì)胞、雙抗DC-T細(xì)胞、雙抗vcDC-T細(xì)胞與PANC1細(xì)胞(20∶1)共培養(yǎng)2、4、6、8、10、12 h對(duì)PANC1細(xì)胞的殺傷率見(jiàn)表2。雙抗vcDC-T細(xì)胞對(duì)PANC1細(xì)胞的殺傷率高于雙抗DC-T細(xì)胞，雙抗DC-T細(xì)胞的殺傷率又高于DC-T細(xì)胞，3組間在不同共培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示維生素C對(duì)雙抗裝載的T細(xì)胞起到增強(qiáng)細(xì)胞功能的作用，4 h時(shí)雙抗vcDC-T 細(xì)胞組的殺傷率較雙抗DC-T組提高20%以上，較DC-T組提高45%以上。

表2 DC-T細(xì)胞、雙抗DC-T細(xì)胞、雙抗vcDC-T細(xì)胞對(duì)PANC1細(xì)胞的殺傷率(%)

討 論

隨著全球環(huán)境的惡化和人們生活習(xí)慣的改變，腫瘤的發(fā)病率越來(lái)越高，腫瘤患者的病死率也逐漸上升，故抗腫瘤藥物的市場(chǎng)將不斷擴(kuò)大[12]。雙特異性抗體是抗體藥物領(lǐng)域中的一個(gè)新概念，被視為腫瘤治療的第二代抗體，擁有廣闊前景。2014年6月一份研究報(bào)告顯示[11]，2023年雙特異性抗體藥物的市場(chǎng)將達(dá)到44億美元。近10年來(lái)，應(yīng)用雙特異性抗體來(lái)進(jìn)行腫瘤治療的研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，多家生物醫(yī)藥公司也開(kāi)展了多種相關(guān)藥物的研發(fā)，有力地證明了雙特異性抗體藥物的有效性[13-14]。

KIF是一類(lèi)具有軸突運(yùn)輸功能的分子馬達(dá)，參與細(xì)胞分裂[6]，2005年首次發(fā)現(xiàn)其成員KIF20A在胰腺癌組織中高表達(dá)[4]。KIF20A是一種微管相關(guān)馬達(dá)蛋白，其生物學(xué)功能主要參與細(xì)胞分裂，以及細(xì)胞器或細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)等[5-6]。近期越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn) KIF20A的上調(diào)與癌癥相關(guān)。一項(xiàng)胰腺癌Ⅰ/Ⅱ期臨床研究[15]結(jié)果顯示，選擇HLA-A24限制性多肽治療的9例胰腺癌患者中4例病情穩(wěn)定，5例療效不理想，疾病有效控制率達(dá)44%，表現(xiàn)出較高水平的抗瘤效應(yīng)。另一項(xiàng)Ⅰ期試驗(yàn)[16]結(jié)果顯示，入組的29例胰腺癌患者通過(guò)1個(gè)月多肽疫苗治療后21例病情穩(wěn)定，疾病有效控制率為72%，其中8例腫瘤縮小，1例病情完全緩解，中位生存期為142 d，無(wú)進(jìn)展生存期為56 d，顯示KIF20A作為治療胰腺癌靶標(biāo)具有良好的選擇性和免疫原性。

本研究應(yīng)用Trust′s試劑將CD3單抗和KIF20A單抗進(jìn)行拆分后再拼接，再經(jīng)過(guò)解耦聯(lián)、分子篩、耦聯(lián)、透析等方法獲得雙特異性抗體，產(chǎn)率近50%。表明通過(guò)選擇商品化的單克隆抗體有明顯的優(yōu)勢(shì)。但同時(shí)也顯示化學(xué)耦聯(lián)率有待提高，以增加雙抗的產(chǎn)率。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)維生素C的干預(yù)[9-10]，vcDC-T細(xì)胞中的T細(xì)胞亞群比例得到優(yōu)化，即CD8+CD28+、CD40L細(xì)胞比例增高，Treg細(xì)胞比例降低，同時(shí)T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌能力也明顯提升，且IL-12的分泌水平顯著改善，說(shuō)明維生素C可將獲得性過(guò)繼免疫與天然免疫相結(jié)合。本研究進(jìn)一步將雙特異性抗體與維生素C刺激相結(jié)合，結(jié)果顯示CD3/KIF20A雙抗能增強(qiáng)DC-T細(xì)胞的靶向效應(yīng)和對(duì)KIF20A+腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，雙抗結(jié)合維生素C刺激能進(jìn)一步增強(qiáng)T細(xì)胞的靶向性及趨向性，增強(qiáng)T細(xì)胞的殺傷能力，并提高細(xì)胞因子的分泌能力，提高治療腫瘤的效能。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突