血清纖維蛋白原β鏈水平對胰腺癌的臨床診斷價值

吳紅培 徐偉松 劉肇修 陳曉君 徐曉耘 紀易斐 江楓 鮑柏軍 肖明兵,4

1南通大學附屬醫院消化內科，南通 226001；2南通市第二人民醫院消化內科，南通 226002；3南通大學附屬醫院感染管理科，南通 226001；4南通大學附屬醫院臨床醫學研究中心，南通 226001

【提要】 采用自建的點免疫印跡法檢測46例胰腺癌患者、58例胰腺良性疾病患者和46例健康體檢者血清中纖維蛋白原β鏈(FGB)的水平。比較各組血清FGB水平，計算FGB診斷胰腺癌的靈敏度和特異度，分析FGB與胰腺癌患者臨床病理參數的關系。結果表明胰腺癌組血清FGB水平顯著高于胰腺良性疾病組及健康對照組，差異有統計學意義(P值均<0.05)。FGB獨立診斷胰腺癌的臨床價值與CA19-9、CEA相似，FGB聯合CA19-9診斷胰腺癌有更高的靈敏度及特異度。胰腺癌患者血清FGB水平與腫瘤臨床分期、淋巴結轉移及遠處轉移相關(P值均<0.05)。

近年來，外泌體在腫瘤的早期診斷中備受關注，它是一種廣泛存在于人體體液的納米級囊泡，其攜帶著癌細胞相關的DNA、RNA和蛋白質等信息，在腫瘤的發生發展中起著重要的作用[1-2]。本課題組前期應用質譜技術在胰腺癌相關外泌體蛋白組學研究中發現多個差異表達蛋白，其中纖維蛋白原β鏈(fibrinogen β chain, FGB)在胰腺癌患者血清外泌體及去外泌體的上清液中水平均較高[3]。本研究進一步建立點免疫印跡法檢測包括外泌體在內的血清總FGB水平，探討其對胰腺癌的臨床診斷價值。

一、資料與方法

1．研究對象：收集2016年12月至2018年11月南通大學附屬醫院及南通市第二人民醫院收治的胰腺癌患者血清標本46例作為胰腺癌組，其中男性28例，女性18例，年齡35～78歲，中位年齡64歲。所有患者診斷均符合《胰腺癌綜合診治指南(2018年版)》[4]的標準，并按照美國NCCN 2017年第2版胰腺癌臨床實踐指南[5]進行臨床分期。同時收集同期住院的胰腺良性疾病患者血清標本58例(急慢性胰腺炎33例，胰腺囊腫25例)作為胰腺良性疾病組，其中男性31例，女性27例，年齡28～89歲，中位年齡58歲。急性胰腺炎、慢性胰腺炎診斷均符合《急性胰腺炎診治指南(2014年版)》[6]、《慢性胰腺炎診治指南(2018年版)》[7]制定的標準。另外收集體檢正常者血清標本46例作為健康對照組，其中男性20例，女性26例，年齡24～73歲，中位年齡53歲。

2．血清標本采集：采集所有入組者的清晨空腹外周靜脈血3 ml，待血液自然凝固20 min后，離心分離血清，分裝后立即儲存于-80℃冰箱待測。

3．自建檢測人血清FGB的點免疫印跡法：取健康對照組混合血清稀釋成不同濃度梯度的對照樣本，將待測樣本及對照樣本加樣至硝酸纖維膜(NC膜)上，以NC膜上的蛋白質或多肽作為抗原，與相應的抗體發生免疫反應，再與辣根過氧化物酶標記的二抗反應，最后經底物顯色，用Image J軟件將圖像掃描，以待測樣本灰度值與對照樣本灰度值比表示待測樣本FGB水平。詳細方法參考筆者申報的發明專利“一種點免疫印跡檢測的檢測裝置及檢測方法(申請號201910367764.7)”及已授權的實用新型專利“一種用于免疫印跡檢測的新型檢測裝置(專利號ZL201920627384.8)”。

4．CA19-9及CEA的檢測：采用電化學發光免疫分析法分別檢測各組患者血清CA19-9、CEA的水平，試劑盒購自美國雅培公司，檢測過程嚴格按照說明書進行。

5．統計學處理：用SPSS 20.0軟件進行數據分析。點免疫印跡法測得的FGB水平均呈非正態分布，以M(P25,P75)表示，3組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗，組內兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料以例(%)表示，FGB 水平與臨床病理參數的相關性比較采用秩和檢驗。繪制FGB、CA19-9、CEA的受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve, ROC)，計算曲線下面積(area under cruve,AUC)，評價觀察指標的診療效能。P<0.05為差異有統計學意義。

二、結果

1．胰腺癌組、胰腺良性疾病組、健康對照組血清FGB水平比較：胰腺癌組、胰腺良性疾病組、健康對照組血清FGB水平分別為0.826(0.457，1.253)、0.535(0.219，0.918)、0.492(0.263，0.788)，胰腺癌組患者血清FGB水平顯著高于胰腺良性疾病組患者及健康對照組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，而胰腺良性疾病組與健康對照組之間的差異無統計學意義(圖1)。

圖1 點免疫印跡法檢測血清FGB示意圖。a為不同濃度的健康對照組混合樣本，b、c、d為同一胰腺癌患者樣本的3個復孔，e、f、g為同一胰腺良性疾病患者樣本的3個復孔，h、i、j為同一健康對照者樣本的3個復孔

2．FGB、CA19-9、CEA及聯合檢測對胰腺癌的診斷價值：血清FGB、CA19-9、CEA診斷胰腺癌的ROC曲線見圖2，AUC分別為0.821(95%CI0.736～0.906)、0.874(95%CI0.794～0.953)、0.763(95%CI0.669～0.857)，診斷界值(cut-off值)分別為0.277、39 U/ml、5.3 ng/ml。血清FGB診斷胰腺癌的靈敏度低于CA19-9及CEA，但特異度高于CA19-9及CEA。FGB聯合CA19-9或CEA診斷胰腺癌靈敏度均達到90%以上，特異度在70%以上，以FGB聯合CA19-9最優，靈敏度高達95.5%，特異度達79.1%(表1)。

圖2 血清FGB、CA19-9、CEA診斷胰腺癌的ROC曲線

表1 血清FGB、CA19-9、CEA診斷胰腺癌的臨床價值

3．胰腺癌患者血清FGB水平與臨床病理參數的關系：點免疫印跡法檢測的胰腺癌FGB水平與腫瘤臨床分期、淋巴結轉移、遠處轉移相關，而與患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位無明顯相關性(表2)。

表2 胰腺癌患者血清FGB水平與臨床病理參數的關系

討論胰腺位于腹膜后間隙，早期胰腺癌患者缺乏特異性的臨床癥狀，因此胰腺癌的早期診斷非常困難。目前，尋找早期發現和早期診斷胰腺癌的標志物已引起廣泛關注。

本課題組前期通過質譜技術對胰腺癌患者血清外泌體進行了蛋白組學分析，篩選出胰腺癌患者高表達的分子——FGB。人纖維蛋白原是一種由肝細胞合成的凝血蛋白，由3對多肽鏈通過29對二硫鍵連接而成的六聚體，分子質量為340 000[7]。纖維蛋白原3條肽鏈分別由簇集于4q28～4q31約50 kb區域內的3個獨立基因纖維蛋白原α(FGA)、纖維蛋白原β(FGB)和纖維蛋白原γ(FGG)編碼[8]。諸多研究表明高纖維蛋白原血癥與惡性腫瘤關系密切，但目前機制尚不清楚。Dipasco等[9]研究認為腫瘤細胞可以直接產生大量的凝血因子，激活體內凝血系統，從而導致纖維蛋白原升高。還有研究表明人體內的腫瘤細胞可以刺激內皮細胞釋放大量凝血相關的組織因子，激活體內凝血過程，導致內皮細胞釋放纖溶酶，抑制纖維蛋白原的降解，使纖維蛋白原升高[10]。纖維蛋白原在胰腺癌中的表達如何，特別是胰腺癌患者血清FGB水平目前尚無文獻報道。

本課題組前期研究發現胰腺癌患者外泌體及去外泌體上清液中FGB水平均較高，因此可以通過直接檢測血清中FGB水平來驗證前期的質譜結果。在此基礎上，筆者建立了點免疫印跡法，這種方法雖然可能不如時間分辨免疫熒光法及化學發光法敏感性高，但它具有獨特的優點，如費用低、用血量較少、不需特殊儀器、可直觀反映血液中蛋白濃度等，最重要的是可將包括外泌體在內的所有血清蛋白吸附在NC膜上進行檢測。本研究結果顯示，胰腺癌患者血清FGB水平顯著高于胰腺良性疾病患者及健康對照者，與質譜分析胰腺癌患者外泌體及去外泌體上清液的FGB結果相契合，表明本研究建立的點免疫印跡法可直接檢測血清FGB水平。ROC曲線分析確定血清FGB水平的截斷值為0.277時，診斷胰腺癌的靈敏度為65.2%，特異度為89.4%，與血清CA19-9、CEA、同樣具有獨立診斷胰腺癌的能力。血清FGB聯合CA19-9診斷的靈敏度達到95.5%，特異度達79.1%，表明聯合檢測優于單項檢測，為胰腺癌的診斷和治療提供了廣闊的前景。

本研究還分析了胰腺癌患者血清FGB水平與腫瘤臨床病理參數的相關性，結果顯示血清FGB水平與胰腺癌臨床分期、淋巴結和遠處轉移相關，推測血清FGB與胰腺癌的惡性生物學行為有關，這有待進一步研究探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突