淋巴細胞活化基因3在惡性腫瘤中的意義及研究進展

高峰，劉子玲

吉林大學第一醫院腫瘤中心腫瘤科，長春 130021

人們對惡性腫瘤免疫治療的探索可以追溯到一百多年前，但由于腫瘤的異質性、免疫系統及腫瘤微環境的復雜性及腫瘤細胞的免疫逃逸能力等，惡性腫瘤的免疫治療直到近年來才有了突破性進展[1]。免疫檢查點是一系列共抑制配/受體通路參與維持機體免疫穩態、自身免疫耐受與抗腫瘤作用之間的平衡，因為它們平衡了共刺激信號并防止了過度的免疫反應。腫瘤可以利用免疫檢查點通路實現免疫逃逸，尤其是逃避針對腫瘤特異性抗原的T細胞免疫反應[2]?？乖蔬f細胞（antigen presenting cell，APC）呈遞的抗原肽-主要組織相容性復合體（peptide-major histocompatibility complex，pMHC）能夠誘導T細胞活化，但免疫檢查點通路發出的負性信號不僅會減弱T細胞活化，還會促進T細胞的功能失活，導致無反應和耐受狀態[3-4]。于是免疫檢查點阻斷（immune checkpoint blockade，ICB）療法應運而生。隨著免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）取得重大進展并逐步應用于臨床，不同機制、不同環節的免疫靶點也相繼被挖掘。作為最受關注的新興免疫靶點之一，淋巴細胞活化基因3（lymphocyte-activation gene 3，LAG3）已經初顯應用前景和臨床價值。本文就LAG3的生物學特性及其在腫瘤免疫治療中的研究進展作一綜述。

1 LAG 3的生物學特性

1.1 LAG 3的結構

LAG3（CD223）是一種由498個氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily，IgSF）成員，對T細胞的功能有多種生物學影響[5]。成熟的LAG3包括4個部分：疏水前導區、細胞外區域、跨膜區和胞質區，其中細胞外區域由4個免疫球蛋白超家族樣結構域（D1～D4）組成，與CD4高度同源，但其與MHCⅡ類分子的親和力較CD4高約100倍[6]。LAG3獨特的胞質結構域具有絲氨酸磷酸化位點、KIEELE序列和谷氨酸脯氨酸重復序列3個部分，其中KIEELE序列對LAG3發揮抑制功能具有關鍵作用，已被證明是LAG3下調T細胞功能的必需成分[7-8]。但是，LAG3發揮作用的具體信號轉導機制仍不清楚[6,9]。LAG3早期被發現表達于活化的T細胞（主要是CD4+T細胞、CD8+T細胞和部分γδT細胞）和自然殺傷（natural killer，NK）細胞，后來證實LAG3也在B細胞、調節性T細胞（regulatory T cell，Treg）和漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cells，pDC）上表達[7,10-11]。LAG3的表達及其與MHCⅡ類分子的親和力在炎性條件下顯著上調，部分炎性因子如白細胞介素（interleukin，IL）-2、IL-7和IL-12等可以提高活化T細胞上LAG3的表達水平[10]。并且，LAG3的結合能力通常與MHCⅡ類分子的表達水平相關[12]。

1.2 LAG 3的配體

MHCⅡ類分子是最早被發現的LAG3配體。LAG3以較高的親和力與MHCⅡ類分子結合，二者相互作用可下調腫瘤浸潤性CD4+T細胞的增殖并抑制細胞因子的分泌，且該過程中伴有LAG3的上調[10]。除了MHCⅡ類分子以外，腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）中的半乳糖凝集素-3（Galectin-3）和肝竇內皮細胞凝集素（liver sinusoidal endothelial cell lectin，LSECtin）也被證實是LAG3的配體[9]。Galectin-3是一種可溶性凝集素，通過LAG3途徑抑制CD8+T細胞的功能并抑制pDC的增殖，從而抵抗機體的抗腫瘤免疫反應，可在多種細胞類型（包括腫瘤細胞）中廣泛表達[4]。因此，Galectin-3與LAG3的相互作用可增強其對TME中腫瘤浸潤性CD8+T細胞的免疫調節作用[13]。LSECtin在肝臟和腫瘤細胞中表達，LSECtin/LAG3通過抑制抗原特異性效應T細胞中γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）的分泌以減弱抗腫瘤免疫反應，采用抗LAG3抗體進行阻斷后可逆轉LSECtin介導的IFN-γ分泌減少[14]。Wang 等[15]研究發現，纖維蛋白原樣蛋白1（fibrinogen like 1，FGL1）是獨立于MHCⅡ類分子的主要的LAG3功能配體。FGL1能夠抑制腫瘤抗原特異性T細胞活化，單克隆抗體對FGL1/LAG3的阻斷可增強機體的抗腫瘤能力。此外，該研究還發現惡性腫瘤患者血漿中高水平的FGL1與預后不良以及對程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱 PD-1）/細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4）抑制劑治療的耐藥性相關，這對于腫瘤免疫治療的發展意義重大。另有研究發現，病理性α-突觸核蛋白原纖維也可以與LAG3結合而發揮生物學作用，病理性α-突觸核蛋白原纖維在神經元之間的傳遞通過LAG3與神經元的結合來完成，由于錯誤折疊的α-突觸核蛋白原纖維在細胞間傳遞可能是帕金森病的一種發生機制，LAG3阻斷或許能夠使帕金森病的治療獲得令人驚喜的效果[16]。總之，目前已發現LAG3具有多個配體，可能還有其他配體尚未被發現，有待于繼續探索并確定是否為有效配體及其與LAG3相互作用的時間和機制，這對LAG3的后續研究至關重要。

2 LAG 3的免疫抑制作用

早期研究已經明確LAG3具有免疫抑制作用，能夠負性調節T細胞的活化，LAG3缺乏或對LAG3進行阻斷可促進T細胞的活化、增殖和細胞因子的產生[5]。如前所述，LAG3在CD4+T細胞、CD8+T細胞、Treg、NK細胞及pDC上均可表達。但LAG3與NK細胞間的作用機制尚不明確[9-12]。有研究表明，IL-12能夠誘導NK細胞中LAG3的表達[17]。LAG3發揮免疫調節作用的機制如下：①通過負性調節作用直接抑制效應T細胞的活化、增殖及功能，并參與T細胞“耗竭”和維持T細胞穩態[5,18-19]；②增強免疫抑制細胞Treg的抑制活性[6,18]；③在腫瘤部位的LAG3介導pDC的激活，而后者可以引導免疫耐受[20-21]。

2.1 LAG 3影響免疫穩態

淋巴細胞尤其是T細胞的數量對免疫穩態的維持具有關鍵作用。T細胞的動態平衡受嚴格調控，產生的細胞池需要滿足兩個條件，既能對抗外來抗原又可防止自身發生過度免疫[18]。在外周，T細胞穩態至少受T細胞抗原受體（T lymphocyte antigen receptor，TCR）、γ鏈細胞因子信號轉導及Treg的抑制活性3個方面調控[18]。LAG3在Treg上組成性表達并可促進其分化，這有助于后者發揮免疫抑制作用，而LAG3阻斷可減弱Treg的功能[9,18]。FOXP3+Treg是維持免疫穩態的重要調節劑[22]。IL-27兼具促炎和抗炎功能，可以通過增強Treg的功能控制某些自身免疫病。研究顯示，IL-27能夠誘導Treg表達LAG3[22]。這些研究從另一方面說明了LAG3通過Treg影響機體的免疫系統。此外，CD4+T細胞上LAG3的表達與γ鏈細胞因子（如IL-2、IL-7、IL-12和 IFN-γ）有關[18]。因此，LAG3破壞了CD4+T細胞的穩態，并且腫瘤浸潤的LAG3+Treg可產生大量的免疫抑制分子IL-10和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）[4]。

2.2 LAG 3與pDC的相互作用

pDC是可以產生Ⅰ型干擾素的樹突狀細胞（dendritic cell，DC）的獨特子集，也可以誘導耐受性免疫應答。靜息狀態下pDC上的LAG3mRNA較T細胞增加約70倍，但LAG3在任何髓樣或淋巴樣DC子集上均不表達[5]。pDC富集到腫瘤部位通常與預后不良有關，因為腫瘤浸潤性的pDC趨向于致耐受性而非免疫性[20]。有研究證實了腫瘤部位存在LAG3介導的pDC激活，并且在腫瘤進展過程中，MHCⅡ類分子/LAG3的相互作用和所導致的pDC激活可能會隨著惡性腫瘤的進展而增加[21]。

2.3 LAG 3對 T細胞的調節

Maruhashi等[12]研究發現，LAG3并非直接與CD4競爭性地結合MHCⅡ類分子，而是通過構象依賴性選擇性地識別穩定的抗原肽-MHCⅡ類分子復合物（pMHCⅡ），進而抑制CD4+T細胞的增殖與活化，這種高度選擇性有助于其維持自身免疫耐受。值得注意的是，腫瘤浸潤性CD4+T細胞上LAG3的表達水平會隨著腫瘤的進展而上調[10]。一項研究發現，LAG3調節CD4+T細胞的方式是調控后者的代謝水平，LAG3缺乏后通過提高線粒體生物發生（即在細胞中形成新線粒體的過程[23]）的水平來增強初始CD4+T細胞的代謝活動。LAG3阻斷后可將部分野生型CD4+T細胞的增殖和代謝表型恢復至LAG3-/-CD4+T細胞的水平，這揭示了LAG3調控CD4+T細胞的另一途徑[24]。

在慢性炎癥環境中（如腫瘤或慢性感染性疾?。?，持續性的抗原暴露和T細胞活化會導致LAG3在T細胞上表達上調，并常與其他免疫抑制性受體如PD-1、T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（T cell immunoglobulin and mucin protein-3，TIM-3）、含Ig及ITIM結構域的T細胞免疫受體（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains，TIGIT）等共表達，導致T細胞免疫功能異常[25]。并且，在慢性病毒性感染和惡性腫瘤中，包括LAG3在內的多個共抑制受體在“疲憊”的CD8+T細胞上均呈高表達[4,26]。“疲憊”的CD8+T細胞存在功能障礙，細胞因子產生減少[5]。盡管這些共抑制受體有利于腫瘤的發生、進展和逃逸，但是對于機體正常的免疫系統穩態是必不可少的。體外自身免疫模型中的研究驗證了LAG3缺乏或功能缺陷會導致無法維持正常的免疫耐受[5]。并且同類型的研究發現，LAG3-/-PD-1-/-型小鼠死于致命的全身免疫，表明了LAG3和PD-1在維持免疫穩態和預防自身免疫病方面具有協同作用[5,27-28]。這也是ICB療法不良反應的一個重要方面。在慢性感染性疾病模型中，LAG3的表達與感染的嚴重程度直接相關，并且其在病毒特異性CD8+T細胞和寄生蟲特異性CD4+T細胞上均與PD-1共表達，LAG3/PD-1協同阻斷可在一定程度上逆轉T細胞的“耗竭”[23]，改善CD8+和CD4+T細胞的免疫功能[29-30]。

臨床前研究顯示，LAG3阻斷增強了CD8+T細胞的功能，并引起較高水平的IFN-γ產生[18]。已有多項研究表明，LAG3在各種惡性腫瘤（如卵巢癌、肝細胞癌、腎癌等）的腫瘤浸潤性CD8+T細胞中過表達[18-19]。Galectin-3和LSECtin主要與LAG3相互作用來調節CD8+T細胞的活化與功能[13-14]。研究發現，多種人類和小鼠腫瘤模型中腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）上的LAG3與PD-1共表達[27,31-32]，二者具有協同作用，LAG3與PD-1協同阻斷改善了CD4+和CD8+TIL的反應[23]，這表明抗LAG3抗體聯合PD-1/程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）可以增強機體的抗腫瘤免疫反應，也為后續的LAG3抑制劑與其他ICI聯合應用的臨床試驗奠定了基礎[22,33-34]。雖然目前對于不同的抑制性受體介導的免疫調節作用的機制尚不完全清楚，但越來越多的證據表明，與單一ICB相比，雙重阻斷在體外和體內均可增強腫瘤抗原特異性CD8+T細胞的功能[26]?？偠灾?，LAG3是T細胞“耗竭”的重要參與者，作為繼PD-1/PD-L1/CTLA4之后的又一關鍵靶點，其對于惡性腫瘤的臨床治療具有重要意義。

3 LAG 3在惡性腫瘤免疫治療中的臨床研究

ICI在惡性腫瘤免疫治療中取得了巨大的成就，尤以PD-1/PD-L1/CTLA4的抑制劑效果最為顯著。然而隨著ICI越來越廣泛地應用于臨床，其存在的問題和局限性也日益凸顯，例如ICI的總體反應率較低、原發或獲得性耐藥以及ICI導致的免疫相關不良反應等。除了解決這些問題，許多研究者也開始尋求新的思路，將探索方向對準新興的免疫治療靶點LAG3，同時多種治療方法組合的模式如ICI聯合嵌合抗原受體T細胞免疫療法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T）、分子靶向治療或雙重ICB等也顯現出一定的臨床獲益。

有研究顯示，人血清中可溶性LAG3（soluble LAG3，sLAG3）的水平代表細胞介導的免疫反應的激活水平，IMP321是sLAG3二聚體的重組形式，是臨床研發的一種APC激活劑，通過MHCⅡ類分子刺激APC以及被APC刺激的次級靶細胞（如記憶T細胞）可以誘導持續的免疫反應，這種方式不同于抗LAG3抗體對LAG3/MHCⅡ類分子相互作用的阻斷[35]。IMP321已經在腎細胞癌、轉移性乳腺癌和黑色素瘤中進行了初期臨床試驗，但僅在小部分患者中觀察到有限的成效[8]。最近一項旨在評估紫杉醇+IMP321對比紫杉醇+安慰劑治療轉移性乳腺癌的研究AIPAC（NCT02614833）正在進行中[35]。此外還有多項將IMP321用于原位免疫（如腫瘤疫苗）的臨床試驗（如NCT01308294、NCT00365937、NCT00324623）以及將IMP321聯合其他ICI治療惡性腫瘤的臨床試驗（如NCT02676869、NCT03625323）均已啟動。

Relatlimab（BMS-986016）是目前開展臨床試驗較多的抗LAG3單克隆抗體，在PD-1/PD-L1治療后進展的黑色素瘤人群中表現出了良好的效果（NCT01968109）[36]。此外還有十余項Relatimab聯合其他ICI的研究開始招募患者或正在進行中。LAG525是另一種人源化抗LAG3單克隆抗體。LAG525的第一項臨床試驗是研究LAG525+PDR001（Spartalizumab，抗PD-1單克隆抗體）治療晚期惡性腫瘤的療效（NCT02460224）。正在進行中的還有LAG525+PDR001用于晚期實體瘤和血液惡性腫瘤的Ⅱ期臨床研究（NCT03365791）[37]。LAG3單克隆抗體MK-4280單獨給藥或聯合派姆單抗（Pembrolizumab）針對晚期實體瘤的臨床研究（MK-4280-001）預計共納入340例患者，目前也正在招募（NCT02720068）[38]。其他的 LAG3抑制劑如 REGN3767[39]、TSR-033[40]和 Sym022[41]也已陸續開展相關臨床試驗。值得一提的是，目前已經研發出同時針對LAG3和PD-1兩個靶點的雙特異性免疫檢查點阻斷劑FS118和MGD013，以達到用一種治療藥物同時阻斷兩種抑制途徑的目的[9]。這一類藥物具有很大的臨床應用潛力，期待能夠產生較單靶點阻斷更好的效果。

4 小結與展望

LAG3被認為是很有潛力的新一代免疫檢查點之一。基于充分的臨床前研究，關于LAG3的臨床試驗已經在多種類型的腫瘤中展開。但仍有諸多問題亟待解決：首先，LAG3的生物學特性復雜，其與配體結合后的下游信號轉導通路仍不明確，這對于研究以LAG3為靶點的藥物十分必要；其次，最近發現的LAG3配體是FGL1，猜測LAG3可能還會存在其他配體，未來是否能夠發現對抗腫瘤作用更為有利的配體作為作用點？再次，機體的免疫系統存在高度的功能冗余，以確保在一個或多個共抑制受體途徑缺陷的情況下仍能維持免疫穩態和正常的免疫耐受[6]，而不同的免疫檢查點作用機制不同，它們之間是否存在特殊的相互作用模式、如何相互作用的，以及如何尋求最優組合治療方案？眾所周知，ICI的臨床應答率有限，因此應尋求合適的預測性生物標志物以篩選合適的人群，更有利于實現腫瘤的精準治療。已有研究分析LAG3的表達與治療反應率的關系，相信不久的將來會有更多的研究針對此方向進行分析?？傮w而言，對LAG3的研究尚處于早期階段，仍需繼續深入研究，以期能夠帶來更多的臨床獲益。