難治性腎病綜合征遺傳背景檢測及其臨床應用

陳思培，李貴森△

(1.電子科技大學醫學院，四川 成都 610000；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院腎內科/腎病研究所，四川 成都 610072)

難治性腎病綜合征(refractory nephrotic syndrome，RNS)藥物治療的效果相對較差，腎臟損害易進行性加重，預后差，是終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)常見原因之一[1]。約10%的兒童特發性腎病綜合征表現為激素抵抗(steroid-resistant nephrotic syndrome，SRNS)，其中30%～40%在10年內會進展到ESRD[2]。目前關于RNS的研究主要集中于對發病機制、治療策略與激素耐藥機制的探討。RNS發病機制尚不完全清楚，多種因素均可導致其發生，主要導致足細胞損傷，進而導致腎小球濾過屏障選擇性喪失和蛋白尿的出現。隨著臨床研究和發病機理研究的不斷深入，已有大量證據表明遺傳變異在RNS發生中至關重要[3]。目前已在足細胞中發現多個基因突變均可導致RNS，影響其一些重要功能[4]。本文針對RNS遺傳背景，結合國內外最新研究成果，重點就導致RNS足細胞相關蛋白基因，在RNS發病中的遺傳變異及其導致RNS的機制和臨床應用價值進行綜述。

1 足細胞裂孔膜的相關蛋白基因

1.1 NPHS1NPHS1基因位于人類染色體19q13.1，所編碼的腎素蛋白(nephrin)是構成裂孔膜(Slit diaphragm，SD)結構的關鍵分子之一，也是裂孔膜上首個被證實的蛋白成分，在維持裂孔膜完整性及信號轉導方面發揮重要功能[5]。NPHS1基因突變主要分為缺失突變和無義突變兩種類型，除此之外也發現數十種包括插入突變、錯義突變和剪切位點突變等基因突變，其中無義突變可導致nephrin蛋白縮短，而錯義突變則影響nephrin蛋白的Ⅲ型纖維連接蛋白結構域[6]。迄今為止，已發現NPHS1基因的173種單基因突變，同時也發現中國SRNS患者中存在NPHS1基因突變[7]。由此看來，NPHS1中的不同突變可能導致SRNS不同臨床癥狀及疾病嚴重程度。因此NPHS1基因突變不僅是CNF病因，也與RNS具有一定聯系。

1.2 NPHS2podocin是一種完整的膜蛋白，是構成膜的關鍵部分，主要表達于足細胞裂孔膜上，可通過直接或間接地結合nephrin，增加nephrin對絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-actixated protein kinases，MAPKs)的誘導刺激，維持裂孔膜的濾過屏障作用。當編碼podocin的NPHS2基因存在突變時可導致SRNS的發生，在約40%的家族性和17%的散發性SRNS病例中均發現該基因的突變[8]。NPHS2基因位于染色體1q25.2，包含25411個核苷酸，啟動子區有2511個核苷酸，其信使RNA有8個外顯子，1853個核苷酸。研究表明，NPHS2基因突變導致podocin與nephrin之間的相互作用的改變被認為是引起SRNS主要原因，現已經發現超過125個NPHS2基因突變，包括歐洲人群中普遍存在的R138Q突變及在NS發病遺傳學中尤為重要的R229Q變體[9]。因此NPHS2基因突變可能是RNS的相關致病基因。

1.3 TRPC6TRPC6基因位于11q21-q22，其編碼的蛋白屬于瞬時受體電位陽離子通道C家族(TRPC)成員，在腎小管和腎小球中均有表達，主要存在于足細胞膜上，能與podocin相互作用，調節裂孔膜介導的足細胞鈣離子內流，從而改變信號傳導影響細胞形態、結構及功能[10]。

TRPC6基因突變可表現出常染色體顯性遺傳的家族性FSGS。至今，已在不同種族及國家的8個FSGS家族中鑒定出TRPC6基因中的11個不同突變，其中5個是功能獲得性突變，主要導致細胞中鈣的內流[11]。TRPC6基因突變曾被認為是遲發性常染色體顯性遺傳性FSGS的遺傳原因，但TRPC6變異體也可在早發性和散發性SRNS患者中存在，如在130例西班牙RNS患者進行TRPC6基因突變篩查中發現3個與疾病相關的錯義突變(約占2%)，該研究進一步確定TRPC6基因突變與散發SRNS的關系[12]。由此可以看出TRPC6基因突變對RNS的發生具有重要意義。

1.4 CD2AP可能參與RNS遺傳形式的另一基因是CD2AP基因。位于染色體6p12的CD2AP所編碼蛋白在足細胞中表達，通過與肌動蛋白和突觸極蛋白相互作用維持足細胞正常細胞骨架結構，同時也與nephrin、podocin等裂孔膜蛋白相互作用，將裂孔膜蛋白固定于細胞骨架，并與血管內皮細胞和腎小球基底膜構成血液濾過屏障，而CD2AP免疫功能異常可引起蛋白尿和腎小球疾病[13]。現已在兒童FSGS患者中發現5種不同CD2AP雜合突變，同時在中國成人散發性FSGS患者中檢測出2號外顯子(160 g>A)及4號外顯子(358 A>G)雜合突變[14]。因此推測CD2AP基因突變與RNS發病相關性較大。

1.5 PLCE1在常染色體隱性NS中發現一種基因突變，該突變導致早發性NS，并可進展為SRNS，其組織學主要表現為彌漫性系膜硬化。磷脂酶ε(PLCE1)基因位于染色體10q23.33染色體上，其編碼蛋白主要在腎小球足細胞表達，調節正常的腎小球發育[15]。磷脂酶ε催化膜磷脂水解并產生肌醇1，4，5-三磷酸和二酰基甘油，若存在突變可破壞細胞生長和分化。PLCE1也與IQGAP-1和nephrin蛋白相互作用，影響細胞粘附?，F已有研究在12個SRNS家族中發現隱性PLCE1致病突變[16]。因此PLCE1基因突變對RNS的發生也至關重要。

1.6 ARHGDIA在哺乳動物中有3種編碼Rho GTP酶解離抑制因子(RhoGDI)的基因，ARHGDIA是其主要編碼基因，定位于染色體17q25.3。ARHGDIA編碼RhoGDIα蛋白，與幾種Rho GTP酶相互作用，包括RhoA、RhoC、Rac1、Rac2和Cdc42。ARHGDIA在大多數組織中表達，而其他2個編碼RhoGDI(RhoGDIβ和RhoGDIγ)的基因顯示組織特異性表達。ARHGDIA突變導致RhoA，Rac1和Cdc42表達上調，損害足細胞，從而導致NS的發生[17]。已有研究發現SRNS中的ARHGDIA突變消除了與Rho GTP酶的相互作用，上調活性GTP結合的Rac1和Cdc42，并導致足細胞的遷移表型改變。Rho GTPase調節廣泛的細胞過程，主要包括細胞粘附，遷移和增殖，因此應嚴格控制其活性[18]。Rho GTP酶信號傳導是NS發病機制的重要組成部分，由此表明ARHGDIA基因突變與RNS相關性較大。

1.7 ACTN4ACTN4定位于染色體19q13，編碼α-輔肌動蛋白4，在多種組織中都高度表達，但僅在腎臟中存在與ACTN4突變相關的臨床表型。α-輔肌動蛋白4主要在裂孔膜中交聯肌動蛋白，ACTN4基因突變將導致肌動蛋白結合減少，引起細胞內蛋白聚集體形成，影響足細胞正常骨架結構，同時改變足細胞裂孔膜的動力學結構，最終導致蛋白尿和FSGS發生。通過電子顯微鏡觀察發現，與野生型ACTN4相比，突變體ACTN4在體外可誘導形成無序和纏結的肌動蛋白聚集體[19]。已有研究在3個FSGS家族中發現ACTN4的三個不同點突變：K255E、T259I和S262P突變，ACTN4突變患者的典型表現是青少年時期或之后出現蛋白尿，并在50多歲時緩慢進展到ESRD，具有晚發性[20]。現有的研究表明ACTN4基因突變與家族性和散發性FSGS相關，因此對于RNS中ACTN4基因突變的作用有待進一步研究。

1.8 ANLN最近，在F-actin結合蛋白基因中發現突變，該基因突變為FSGS的新病因。ANLN基因主要位在染色體7p15-p14，對發育過程中的胞質分裂非常重要。ANLN基因突變可導致家族性FSGS，ANLN突變型與裂孔膜CD2AP蛋白結合能力降低，從而影響其與PI3K通路的相互作用，并通過過度激活PI3K/AKT/mTOR/p70 S6K/Rac1信號轉導引起足細胞功能的多重紊亂[21]。ANLN基因突變可導致FSGS發生，仍需探討其與RNS發生的關聯性。

2 足細胞線粒體相關蛋白基因

輔酶Q10(泛醌)是細胞膜的脂溶性成分，對于線粒體內膜呼吸鏈中的電子傳遞非常重要。與輔酶Q10生物合成相關的幾個基因的突變與SRNS相關，包括COQ2，COQ6，異戊二烯基二磷酸合酶亞基2(PDSS2)和含有aarF域激酶4(ADCK4)，這些基因的突變可引起輔酶Q10水平降低，從而降低線粒體呼吸酶活性，導致足細胞損傷[22]。

3 足細胞粘附GBM相關蛋白基因

3.1 LAMB2LAMB2編碼層粘連蛋白β2的突變可導致常染色體隱性遺傳疾病-Pierson綜合征，其特征為神經發育缺陷與腎臟微小病變。在FSGS患者中也發現LAMB2突變，LAMB2基因定位于染色體3p21，其錯義突變R246Q可破壞層粘連蛋白分泌，可能與神經系統異常缺失和腎臟疾病發病年齡偏高有關，也可能發生RNS[23]。

3.2 COL4ACOL4A5基因定位X染色體Xq22，其突變將導致X連鎖Alport綜合征發生，其特征是出現血尿和進行性腎功能不全。COL4A3(2q36-q37)和COL4A4(2q35-q37)純合的或雜合突變可引起常染色體隱性遺傳的Alport綜合征，同時在10%SRNS和FSGS患者中也發現COL4A3-5突變，表明該突變與RNS具有相關性[24]。

4 足細胞核轉錄因子相關基因

4.1 WT1WT1基因位于染色體11p13，編碼一種鋅指樣轉錄因子(Zinc finger transcription factor)蛋白，主要表達于腎臟和造血細胞中，通過識別并結合特異性靶基因以調控其轉錄[25]。已知多種腎臟疾病與WT1基因突變相關，如散發性SRNS。WT1基因突變所致腎病其臨床起病隱匿，即使出現大量蛋白尿卻未出現浮腫現象。在散發性SRNS患兒的研究中發現9例女性患兒存在WT1基因突變，突變檢出率為3.9%，其突變位點主要位于在第8和9外顯子，同時也在2例中國SRNS患兒中發現WT1基因突變[26]。從上述證據中表明，WT1基因突變也可能存在于RNS中。

4.2 SMARCAL1SMARCAL1編碼ATP驅動的DNA退火解旋酶，在腎臟中廣泛表達，主要存在于足細胞中。SMARCAL1基因定位在染色體2q34-36，在基因調控過程中與DNA-核小體相互作用，影響染色質重塑。SMARCAL1突變導致Schimke免疫性骨發育不良，并伴有生長障礙和T細胞功能受損，以及發生FSGS或RNS[27]。

4.3 NXF5核RNA輸出因子5(NXF5)編碼核孔復合物相關蛋白，主要參與細胞核輸出mRNA。NXF5在X染色體Xq22中的突變導致X連鎖的FSGS及相關的心臟阻滯[28]。因此NXF5突變可能參與RNS過程。

5 其他基因

溶酶體蛋白的突變也可引起SRNS，如SCARB2編碼溶酶體膜蛋白，其突變可導致伴肌萎縮腎功能衰竭[29]。大量研究發現APOL1存在突變，主要包括G1(錯義S342 g和I384 M)和G2(C-末端六個堿基對缺失)，在非洲人群的患者中較為常見，同時在約35%非洲裔美國人中也發現該基因突變體。APOL1等位基因純合子或復合雜合子突變個體發生FSGS的風險增加[30]。除此之外，自2017年3月起，已發現70多個腎相關基因，包括最近報道與SRNS相關的基因，如NUP93、NUP107、NUP205、KANK1、KANK4、MAGI2和EMP2等[31]。

6 總結與展望

分子遺傳學和基因組科學的快速發展極大地提高了我們對RNS分子基礎的認識，使疾病的精準診療成為可能。基因突變鑒定的潛在益處，主要包括選擇適當的治療方式、了解臨床腎外表現、評估預后。同時早期遺傳診斷可能影響移植管理，以及遺傳檢查可以指導臨床管理。鑒于RNS的難治性，基因突變為診斷和基于機制的治療提供突破方向。盡管這些進展也給臨床醫生及其患者和家庭的臨床應用帶來了重大挑戰，但基因診斷的發展為開發個體化治療方法提供前所未有的機會，為患有RNS的兒童和成年人提供更好的診斷、治療及預后。