TLR4促進苯腎上腺素誘導的心肌細胞肥大

韋 玲 聞 明

(天津市泰達醫院，天津 300457)

心肌肥厚是心臟在生理性或者病理性刺激下發生的適應性改變，可分為生理性心肌肥厚和病理性心肌肥厚[1]。生理性心肌肥厚是在妊娠、運動等生理性刺激下心肌細胞發生的代償性改變，心肌細胞沿著橫軸方向增大，可引起心臟收縮功能增強，但不會進展為心力衰竭[2，3]；病理性心肌肥厚則是由心肌損傷、代謝紊亂、血管病變等病理性刺激誘發的心臟負荷超載的代償性改變，表現為心肌細胞沿著縱軸方向增大、心肌細胞收縮功能下降、蛋白質合成增多、胚胎基因的重新激活以及心肌細胞的凋亡和心肌纖維化等不可逆改變，是心臟疾病向心力衰竭進展的必然過程[4-6]。目前，心肌肥厚的發病機理尚未完全闡明，臨床上尚缺乏有效的治療手段，因此，探索病理性心肌肥厚發生的分子機制，尋找新的藥物作用靶點，改善病理性心肌肥厚的治療方案，對于人群健康具有重要意義。

本研究通過分析GEO數據庫中人及小鼠心肌肥厚組織的測序數據，借助R軟件篩選出目的基因Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)，并通過后續細胞實驗探究其對PE誘導的原代心肌細胞肥大的影響及可能的作用機制，以期為探索新的抗心肌肥厚藥物治療靶點和策略提供依據。

1 材料與方法

1.1材料 胰蛋白酶和膠原酶Ⅱ購自美國Sigma公司；Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑購自美國Invitrogen公司；PE購自英國Abcam公司；TLR4特異性siRNA序列(siTLR4)及對照組序列(siNeg)購自上海生工生物有限公司；TLR4過表達腺病毒(AdTLR4)及相應對照組病毒(AdEGFP)購自上海漢恒生物科技有限公司；抗TLR4、IL-6、p-Stat3、t-Stat3和GAPDH一抗均購自美國CST公司。

1.2方法

1.2.1原代心肌細胞培養 選取出生后2～3 d的新生大鼠，斷頸處死后取出心臟組織，置于培養皿中，加入PBS緩沖液，洗滌后剪去心房組織。用剪刀將心臟組織剪碎，加入5 ml含0.1%的胰蛋白酶和0.04%的膠原酶Ⅱ的消化液，置于恒溫搖床中，37℃消化20 min后，收集消化液，在剩余組織中添加消化液，繼續消化，重復4～5次，心臟組織消化完全后將收集的消化液混合，1 500 r/min 離心10 min，棄上清，用含有10%胎牛血清的DMEM完全培養基重懸細胞，2 000目過濾后采用差時貼壁法去除成纖維細胞，用DMEM完全培養基重懸，調整細胞密度為1 × 105個/ml，接種在6孔板中，2 ml/孔，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。

1.2.2細胞轉染與分組 原代心肌細胞用冷PBS洗滌后用含1%ITS的DMEM培養基培養。將3 μl siRNA或5 μl Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑分別與100 μl Opti-MEM培養基混合，室溫靜置5 min后，將siRNA與轉染試劑混合后靜置15 min，加入6孔板中。轉染后8 h換液，48 h收集細胞檢測敲低效率。腺病毒感染參照公司提供的相關步驟，即原代心肌細胞換液后，分別在每孔中加入對照組病毒和TLR4過表達病毒，感染24 h后換液，48 h收集細胞檢測過表達效率。細胞共分為4組：siNeg組、siTLR4組、AdEGFP組、AdTLR4組。

1.2.3WGA染色 原代心肌細胞用冷PBS浸洗3次，每次5 min，室溫下用4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗3次后，加入WGA(Wheat germ agglutinin)工作液，室溫下避光孵育30 min，PBS浸洗后，用0.2% Triton X-100通透10 min，使用DAPI進行細胞核染色，隨后使用正置顯微鏡進行拍照，心肌細胞面積使用Image J軟件進行分析。

1.2.4qRT-PCR 原代心肌細胞用冷PBS洗滌后，加入1 ml Trizol，冰上裂解20 min后，用細胞刮板收集細胞，Trizol法提取總RNA，取0.5 μg總RNA進行逆轉錄，最后進行實時熒光定量PCR檢測目的基因的mRNA水平，TLR4引物序列為：F：5′-TGGCATTGTTCCTTTCCTGC-3′，R：5′-GTTTAAGCCATGCCA-TGCCT-3′。β-actin引物序列為：F：5′-GGCATCCTGACCCTGAAGTA-3′，R：5′-AGGCATACAGGGACA-ACACA-3′。qRT-PCR反應條件為：94℃ 2 min；94℃ 30 s,60℃ 20 s,70℃ 20 s，共計35個循環，基因表達水平采用2-ΔΔCt法計算。

1.2.5Western blot 原代心肌細胞用冷PBS洗滌2次后，RIPA上裂解30 min，用細胞刮板收集細胞，提取總蛋白。取20 μg總蛋白行10%或12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，常規轉膜封閉后將PVDF膜置入相應的一抗中4℃孵育過夜，TBST洗滌2次后，室溫孵育辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶10 000)，使用ECL試劑盒進行曝光分析。目的蛋白表達水平 =目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.2.6差異基因篩選 原始數據集GSE42955和GSE56348下載自GEO數據庫，使用R軟件及Limma功能包篩選差異表達基因，設置篩選條件為：|log2(Fold Change)|>0.5且P<0.05。使用及ggplot2等功能包進行數據可視化。

2 結果

2.1心肌肥厚生物信息學分析 選取GEO數據庫中數據集GSE42955，共含有17個人心臟組織樣本，其中正常心臟組織(Ctr)5個，擴張性心肌病心臟組織(DCM)12個。對該數據集分析發現，與正常心臟組織相比，DCM組織中有372個基因表達水平發生改變，其中160個基因上調，212個基因下調(圖 1A)；選取數據集GSE56348，共含有10個小鼠心臟組織，其中假手術組心臟組織(Sham)5個，主動脈縮窄手術組心臟組織(TAC)5個，對該數據集分析發現，與Sham組相比，TAC組中有575個基因表達水平發生改變，其中421個基因上調，154個基因下調(圖 1B)。

圖1 心肌肥厚組織生物信息學分析Fig.1 Bioinformatics analysis of cardiomyocyte hyper-trophy tissues

2.2TLR4在心肌肥厚組織中高表達 對數據集GSE42955和GSE56348聯合分析發現， 共有32個基因表達水平在人和小鼠心肌肥厚組織中發生改變(圖 2A)。與正常心臟組織(Ctr)相比，擴張性心肌病心臟組織(DCM)中TLR4表達水平顯著增加(P=0.014)(圖 2B)；與假手術組小鼠心臟組織(Sham)相比，主動脈縮窄手術組小鼠心臟組織(TAC)中TLR4表達水平顯著增加(P=0.007 9)(圖 2C)。

圖2 TLR4在心肌細胞肥厚組織中高表達Fig.2 TLR4 is over-expressed in cardiomyocyte hyper-trophy tissues

2.3PE處理原代心肌細胞誘導TLR4表達增加 用PE處理原代心肌細胞48 h后，心肌肥厚標志物Anp、Bnp、Myh7的mRNA水平顯著上升，Myh6的mRNA水平顯著降低(圖 3A)。心肌細胞面積分析發現，PE處理組心肌細胞面積顯著高于對照組心肌細胞(圖3B)。qRT-PCR和Western blot結果表明，PE處理48 h后，心肌細胞中TLR4基因mRNA和蛋白水平均顯著增加(圖3A、C、D)。

圖3 苯腎上腺素處理原代心肌細胞誘導TLR4表達上升Fig.3 Phenylephrine treatment induces increased expres-sion of TLR4 in primary cardiomyocytesNote:Compared with Control，*.P<0.05，**.P<0.01.

2.4敲低TLR4抑制PE誘導的心肌細胞肥大 通過siRNA轉染原代心肌細胞，敲低TLR4表達水平，qRT-PCR和Western blot結果表明，與siNeg組相比，siTLR4組心肌細胞中TLR4的mRNA和蛋白水平顯著降低(圖 4A～C)。在PE處理下，敲低TLR4能逆轉PE導致的Anp和Bnp的mRNA水平升高(圖 4D、E)。心肌細胞面積分析發現，敲低TLR4能抑制PE誘導的心肌細胞面積增加(圖 4F)。

圖4 敲低TLR4抑制PE誘導的心肌細胞肥大Fig.4 Knock-down TLR4 inhibits PE-induced cardiomyo-cyte hypertrophyNote:Compared with siNeg，*.P<0.05，**.P<0.01;compared with control,##.P<0.01.

2.5過表達TLR4促進PE誘導的心肌細胞肥大 通過腺病毒感染的方式過表達心肌細胞中TLR4表達水平，qRT-PCR和Western blot結果表明， 與AdEGFP組相比，AdTLR4組心肌細胞中TLR4的mRNA和蛋白水平顯著增加(圖 5A～C)。在PE處理下，過表達TLR4能促進PE導致的Anp和Bnp的mRNA水平升高(圖 5D、E)。心肌細胞面積分析發現，過表達TLR4能促進PE誘導的心肌細胞面積增加(圖 5F)。

圖5 過表達TLR4促進PE誘導的心肌細胞肥大Fig.5 Over-expression TLR4 promotes PE-induced cardiomyocyte hypertrophyNote:Compared with AdEGFP,*.P<0.05，**.P<0.01；compared with Control,#.P<0.05,##.P<0.01.

2.6TLR4對IL-6/Stat3信號通路的影響 Western blot結果表明，PE處理導致心肌細胞中IL-6和p-Stat3水平顯著上升，t-Stat3水平變化無統計學意義(圖6A、C)。在PE處理下，敲低TLR4能引起心肌細胞中IL-6和p-Stat3表達水平降低(圖 6A、B)，過表達TLR4能導致心肌細胞中IL-6和p-Stat3表達水平顯著上升(圖 6C、D)。

圖6 TLR4對IL-6/Stat3信號通路的影響Fig.6 Effect of TLR4 on IL-6/Stat3 signal pathwayNote:Compared with siNeg or AdEGFP，*.P<0.05，**.P<0.01；compared with siNeg+PE or AdEGFP+PE，#.P<0.05，##.P<0.01.

3 討論

TLR4屬于TLRs蛋白家族，目前已發現，該家族共含有13種TLRs蛋白，均屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白受體，由富含亮氨酸重復序列的胞外段、跨膜區和胞內結構域組成，其中TLR4是哺乳動物中最早發現的TLRs[7，8]。研究表明，TLR4在包括單核/巨噬細胞、內皮細胞、腎小管上皮細胞等多種哺乳動物細胞中廣泛表達，通過識別包括熱休克蛋白、胎球蛋白A、纖連蛋白等在內的內源性配體和細菌脂多糖、核酸等外源性配體，激活下游信號通路而發揮重要功能，參與調控天然免疫和獲得性免疫過程，與腫瘤、心血管疾病、免疫性疾病等多種疾病密切相關[9-11]。既往大量研究表明，TLR4與冠心病、高血壓、心力衰竭、心肌梗死等心血管疾病密切相關，而TLR4與病理性心肌肥厚發生發展也有相關文獻報道[12-14]。Li等[15]研究表明，長鏈非編碼RNA MIAT(myocardial infarction-associated transcript)可通過海綿吸附miRNA-93進而上調TLR4的表達水平，從而促進病理性心肌肥厚的發生。Li等[16]發現，在壓力負荷下，NLRP3基因敲除能促進小鼠發生病理性心肌肥厚，進一步機制研究發現，NLRP3敲除可引起TLR4高表達，TLR4抑制劑能緩解NLRP3基因敲除小鼠在壓力負荷下出現的心肌肥厚和心功能下降，這些研究均提示TLR4在病理性心肌肥厚中的重要作用，而具體機制有待進一步闡明。

本研究通過分析GEO數據庫中數據集GSE42955和GSE56348，發現與相應正常心臟組織相比，在人和小鼠肥厚心臟組織中有32個基因表達水平均發生改變，其中，TLR4基因在人和小鼠肥厚心臟組織中呈現高表達。隨后，本研究使用PE處理新生大鼠原代心肌細胞48 h，然后檢測Anp、Bnp、Myh6、Myh7等心肌肥厚的重要標志物，并通過WGA染色及心肌細胞面積分析發現，PE能明顯誘導心肌細胞肥大，表明PE誘導的新生大鼠原代心肌細胞肥大模型成功建立。隨后，本研究檢測了PE處理48 h后，原代心肌細胞中TLR4基因蛋白和mRNA水平，發現在PE刺激后，TLR4基因蛋白和mRNA水平均顯著增加。這些結果提示TLR4在心肌肥厚發生過程中具有重要作用，因此本研究選擇TLR4作為目的基因。為進一步探究TLR4在心肌肥厚中的作用，本研究設計TLR4特異性siRNA和TLR4過表達腺病毒進行細胞水平和分子水平的驗證。結果表明，在PE處理下，敲低TLR4能逆轉PE導致的Anp和Bnp的mRNA水平升高。心肌細胞面積分析發現，敲低TLR4能抑制PE誘導的心肌細胞面積增加，說明敲低TLR4能抑制PE誘導的心肌細胞肥大。相反，上調TLR4能顯著促進PE誘導的心肌細胞肥大，這些結果表明，TLR4在心肌肥厚中具有重要作用。

IL-6是一種在細胞內廣泛存在的多效能細胞因子，通過與其受體結合，誘導激活下游JAKs家族成員，包括絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activation protein kinase，MAPK)，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PⅠ3K)和信號轉導及轉錄激活因子3(signal transduction and activator of transcri-ption 3,Stat3)，從而廣泛參與調控炎癥反應，與細胞增殖、分化、凋亡密切相關，參與惡性腫瘤、糖尿病、心血管疾病等的發生、發展[17，18]。既往研究表明，IL-6/Stat3信號通路與病理性心肌肥厚的發生、發展密切相關[19-21]。Chen等[19]發現，在血管緊張素Ⅱ誘導的病理性心肌肥厚過程中伴隨著IL-6/Stat3信號通路依賴的炎癥反應的激活；Chen等[20]研究表明，在血管緊張素Ⅱ處理下，IL-6基因敲除能緩解小鼠病理性心肌肥厚的發生，改善心功能；Zhao等[21]研究發現，敲除IL-6能減輕壓力超負荷引起的左心室肥大和功能障礙，與Stat3磷酸化水平降低有關，這些研究均表明，IL-6/Stat3信號通路在心肌肥厚發生中具有重要作用。因此，為進一步探究TLR4作用機制，本研究檢測了TLR4敲低或者過表達對IL-6/Stat3信號通路的影響。結果表明，PE處理導致心肌細胞中IL-6和p-Stat3水平顯著增加，t-Stat3水平無顯著改變，說明在肥厚刺激下，IL-6/Stat3信號通路處于激活狀態，這與既往研究相符。在基礎水平下，敲低或過表達TLR4對IL-6和p-Stat3水平無明顯影響，而在肥厚刺激下，敲低TLR4能引起心肌細胞中IL-6和p-Stat3表達水平降低，過表達TLR4能導致心肌細胞中IL-6和p-Stat3表達水平顯著增加，以上結果表明，TLR4可能是通過調控IL-6/Stat3信號通路從而影響病理性心肌肥厚的發生。不過，本研究尚未深入探究TLR4激活IL-6/Stat3信號通路的具體機制，也未能進行逆轉實驗驗證抑制IL-6/Stat3信號通路活性能否減弱TLR4過表達對PE誘導的心肌細胞肥大的促進作用，有待進一步探索。

總之，本研究基于GEO數據庫，利用生物信息學手段，篩選出與病理性心肌肥厚發生有關的基因TLR4，敲低TLR4可能是通過抑制IL-6/Stat3信號通路緩解PE誘導的心肌細胞肥大的發生，TLR4可能是潛在的治療心肌肥厚藥物的作用靶點。