益心泰丸對阿霉素致心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡的影響及作用機制①

孫 濤 郭志華 曾 英

(湖南中醫藥大學第一附屬醫院心血管科，長沙 410000)

心力衰竭(heart failure，HF)是由于心臟損傷引起的心排血量減少不能滿足機體代謝需要而引起的一系列綜合征，臨床表現為咳嗽、呼吸困難、倦怠和乏力等，在美國，每年有400億美元用于治療HF[1，2]。HF是以心肌細胞壞死導致心臟功能障礙的特異性疾病，其主要特點心肌細胞肥大、壞死及纖維化導致射血動力不足，心臟功能不全、HF等[3]。文獻報道稱造成HF的主要原因有炎癥感染、心肌細胞壞死、心肌能量代謝紊亂等，因此從上述因素尋找治療HF的手段，成為當前醫務工作者不斷探尋的課題[4-6]。益心泰丸主要由黃芪、丹參、紅花、澤瀉、豬苓等中藥組成，研究表明益心泰丸具有改善血流動力、抑制心室重構、減緩HF、抑制心肌凋亡、抑制炎癥因子等作用，但其作用機制尚未見有報道[7，8]。在細胞凋亡過程中，磷脂酰肌醇3-激酶∕蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路對相關蛋白的調節發揮關鍵作用，可將膜受體信號傳遞至細胞內，來實現維持細胞增殖和抑制細胞凋亡過程。作為Akt的底物，糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是調節細胞凋亡的關鍵元件[9]。本研究采用HDR誘導的HF大鼠為模型，從PI3K/Akt/GSK-3β信號通路探討益心泰丸對ADR誘導的HF大鼠心功能的保護作用，從而為其臨床應用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物 清潔級Wistar大鼠由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號: SCXK(湘)2009-0001。

1.1.2主要試劑 阿霉素購自Sigma公司；TUNEL試劑盒購自博士德生物公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、化學發光試劑盒購自廣東銳博生物科技技術股份有限公司；兔抗鼠Akt、p-Akt、GSK-3β、P-GSK-3β、兔抗GAPDH以及山羊抗兔IgG采購自美國Abcam公司；IL-6、TNF-α檢測試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；PRA、AngⅡ、ALD 試劑盒購自尚柏生物醫學技術有限公司。

1.2方法

1.2.1模型構建和分組處理 實驗前大鼠適應性飼1周，隨機分為4組，每組15只，分別為空白對照組，模型組、益心泰丸組和開博通組，實驗前禁食24 h，腹腔注射2.5 mg/kgADR，48 h后二次注射ADR(2.5 mg/kg)構建模型，彩超檢測心功能障礙時提示模型構建成功，空白組和模型組給予等體積的生理鹽水，益心泰丸組和開博通組分別灌胃給予相應藥物5 mg/kg，連續給藥4周。

1.2.2大鼠血漿內PRA、AngⅡ、ALD含量變化情況檢測 給藥4周后空腹尾部采血，采用PRA、AngⅡ、ALD試劑盒檢測各指標變化。

1.2.3超聲檢査心臟結構的變化 給藥4周后，麻醉大鼠，固定于手術臺，心臟彩超檢查心臟功能和心臟結構情況。記錄左室收縮期(LVPWs)、舒張期后壁厚度(LVPWd)等數據。

1.2.4HW/BW檢測 大鼠處死后，打開胸腔暴露心臟，結扎取心臟，生理鹽水洗凈血液，吸水紙吸干，稱取心臟重量，計算HW/BW。

1.2.5HE染色觀察大鼠心肌組織的病理學改變 取新鮮心臟組織，生理鹽水洗滌，10%中性甲酸緩沖液固定12 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟、銅質模具包埋，連續切片4 μm 的組織切片，二甲苯脫蠟、水化 ，經蘇木精-伊紅染色，65℃ 2 h，生理鹽水沖洗，鹽酸酒精分化，PBS洗滌，伊紅染色，梯度酒精脫水，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.2.6TUNEL染色檢測大鼠心肌細胞凋亡情況 將大鼠心肌細胞石蠟切片，3%H2O2浸洗3次，PBS洗滌3次，0.01 mol/L TBS緩沖液沖洗，0.01 MTBS，加入蛋白酶K溶液工作液在30℃室溫水解15 min，PBS洗滌3次，加入含2%H2O2的PBS反應10 min，PBS洗滌；然后加入TUNNEL反應混合液，加封口膜在暗濕盒中反應60 min，溫度37℃，PBS漂洗，加50 μl的 conberter-POD，加封口膜在暗濕盒中反應1 h，溫度37℃，PBS漂洗，然后加入DAB 20℃反應15 min，PBS漂洗，蘇木素復染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察，凋亡陽性細胞呈棕黃色，在光學顯微鏡下計數，5個高倍視野中凋亡陽性心肌細胞數量占總細胞數量為細胞凋亡陽性指數AI。

1.2.7ELISA法檢測血清TNF-α和IL-6的表達 給藥4周后尾部采血，2 000 r/min離心10 min，取上清按照ELISA試劑盒說明書操作檢測血清中TNF-α和IL-6水平。

1.2.8Western blot檢測Akt、p-Akt、GSK-3β、P-GSK-3β 凍存的心肌組織加入RIPA組織裂解液中勻漿器打碎，冰浴5 min后，離心，離心條件：13 000 r/min，4℃，時間10 min，獲得上清液，BCA蛋白定量試劑盒進行上清液中蛋白濃度的定量檢測，用2倍電泳緩沖液稀釋蛋白至相同濃度。10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，用Tris/甘氨酸緩沖液將蛋白轉移至PVDF膜上，5%TBST液中室溫封閉2 h，將PVDF膜放入相應一抗稀釋液(均為1∶1 000)中孵育，4℃過夜。次日，將膜取出，TBST液洗滌10 min，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗稀釋液(均為1∶10 000)，室溫孵育2 h，加入DAB發光液，凝膠成像儀下讀取讀取灰度值，以GAPDH作為內參，計算目的蛋白相對表達水平。

1.3統計學分析 數據統計采用SPSS16.0軟件，作圖工具采用Graphpad5.01，組間比較采用t檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1益心泰丸對ADR誘導HF大鼠血漿內 PRA、AngⅡ、ALD含量的影響 如圖1所示，模型組的PRA、AngⅡ、ALD水平顯著高于空白組，差異具有統計學意義(P<0.05)。益心泰丸組和開博通組PRA、AngⅡ、ALD顯著低于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)；益心泰丸組、開博通組差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2益心泰丸對ADR誘導HF大鼠心肌厚度的影響 模型組的LVPWs、LVPWd、IVSs、IVSd、HW/BW顯著高于空白組，差異具有統計學意義(P<0.05)，益心泰丸組和開博通組的LVPWs、LVPWd、IVSs、IVSd、HW/BW顯著低于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)，益心泰丸組、開博通組，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 益心泰丸對ADR誘導HF大鼠心肌厚度的影響Fig.2 Effect of Yixintai Pill on myocardial thickness of ADR-induced HF ratsNote:Compared with model group,*.P<0.05.

2.3益心泰丸對ADR誘導HF大鼠心肌組織病理學的影響 模型組大鼠心肌呈片狀壞死、空泡性變性、心肌纖維增多、心肌細胞片狀溶解；空白組大鼠心肌細胞排列整齊、少量成纖維細胞、心肌細胞結構清晰；益心泰丸組和開博通組心肌纖維化、變性等較輕，肌纖維變性、纖維組織增生明顯減少，見圖3。

圖3 益心泰丸對ADR誘導HF大鼠心肌組織病理學的影響Fig.3 Effect of Yixintai Pill on myocardial histopathology of ADR-induced HF ratsNote:A.Blank group；B.Model group；C.Captopril group；D.Yixintai Pill group.

2.4益心泰丸對ADR誘導HF大鼠心肌細胞凋亡的影響 TUNEL染色凋亡陽性心肌細胞核呈棕黃色。與空白組相比，模型組AI數值明顯升高，益心泰丸組、開博通組與模型組相比AI數值均明顯下降更明顯，差異均具有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 TUNEL染色檢測益心泰丸對ADR誘導HF大鼠心肌心肌細胞凋亡的影響Fig.4 TUNEL staining was used to detect effect of Yixintai Pill on myocardial cell apoptosis induced by ADR in HF ratsNote:A.Blank group；B.Model group；C.Captopril group；D.Yixintai Pill group;compared with model group，*.P<0.05;compared with blank group,#.P<0.05.

2.5益心泰丸對ADR誘導HF大鼠心肌細胞TNF-α和IL-6的影響 模型組的TNF-α和IL-6顯著高于空白對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，益心泰丸組和開博通組的TNF-α和IL-6水平顯著低于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)，益心泰丸組、開博通組差異無統計學意義(P>0.05),見圖5。

圖5 益心泰丸對ADR誘導HF大鼠心肌細胞TNF-α和IL-6的影響Fig.5 Effect of Yixintai Pill on TNF-α and IL-6 in myoc-ardial cells of HF rats induced by ADRNote:Compared with blank group，#.P<0.05；compared with model group，*.P<0.05.

2.6益心泰丸對ADR誘導HF大鼠心肌組織Akt、p-Akt、GSK-3β、P-GSK-3β的影響 與空白組相比，模型組p-Akt、P-GSK-3β水平明顯下降，益心泰丸組和開博通組的p-Akt、P-GSK-3β顯著高于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)，益心泰丸組、開博通組差異無統計學意義(P>0.05)，見圖6。

圖6 益心泰丸對ADR誘導HF大鼠心肌組織Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β的影響Fig.6 Effect of Yixintai Pill on myocardial Akt,p-Akt,GSK-3β,p-GSK-3β induced by ADR in HF ratsNote:Compared with model group,*.P<0.05；compared with blank group，#.P<0.05.

3 討論

益心泰丸具有增強機體免疫、利尿、保肝、降壓、擴張冠狀動脈、改善心臟功能，調整心律，改善微循環等作用[10]。本研究采用ADR構建HF模型，觀察益心泰丸治療HF的效果，結果顯示益心泰丸能夠明顯降低HF模型大鼠血漿內 PRA、AngⅡ、ALD的含量，證明益心泰丸可抑制RAAS 過度激活保護心肌細胞，改善心臟功能。國內學者楊明等[11]研究表明益心泰丸能能夠顯著降低HF模型大鼠血漿內PRA、AngⅡ、ALD的含量，與本文研究結果一致。

HF是由于心肌細胞壞死導致心臟功能障礙，嚴重危害人們身體健康的一種疾病，其特點主要以心臟纖維壞死、心臟射血動力不足、心臟功能不全等癥狀為主[12]。文獻報道稱HF最先出現左心室功能損害，隨著病情的發展不斷惡化影響其他心肌結構與功能，最終引起不可逆的心力衰竭[13]。本研究中的超聲結果顯示模型組的LVPWs、LVPWd、IVSs、IVSd、HW/BW顯著高于空白對照組，提示心臟的左心室結構出現了損害，而益心泰丸組的LVPWs、LVPWd、IVSs、IVSd顯著低于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)，說明益心泰丸保護ADR大鼠的心臟功能。

HF發病機制尚不明確，文獻報道稱，心肌細胞凋亡、心室重構在 HF的發生發展中起重要作用，是HF發生重要因素之一，阻斷心肌細胞凋亡可以降低HF的發病率，延緩HF的發展速度，改善心臟各項功能[14，15]。本研究HE染色結果顯示模型組大鼠心肌呈片狀壞死、空泡性變性、心肌纖維增多、心肌細胞片狀溶解，提示HF大鼠的心臟細胞結構發生明顯改變，而益心泰丸可以使心肌纖維化變性較輕，減少纖維組織增生。既往研究結果顯示益心泰丸可以明顯抑制心肌梗死模型大鼠心肌細胞凋亡[16]。本研究中TUNNEL染色結果顯示HF組大鼠心肌細胞凋亡明顯，凋亡指數明顯高于空白組，口服益心泰丸后，心肌細胞凋亡指數明顯下降。

研究表明PI3K/Akt/GSK-3β信號通路的活化是心室重構的重要信號轉導通路之一，該信號通路激活與心肌細胞凋亡密切相關[17]。本研究結果顯示與空白組相比，模型組p-Akt、p-GSK-3β水平明顯下降，益心泰丸組和開博通組的p-Akt、p-GSK-3β顯著高于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)，益心泰丸組、開博通組相比，差異無統計學意義(P>0.05)，從而提示PI3K/Akt/GSK-3β信號通路參與了HF的發生發展，采用益心泰丸處理后，p-Akt、p-GSK-3β水平明顯升高，說明益心泰丸可能是通過上調PI3K/Akt/GSK-3β信號通路來保護HF的心臟功能。

綜上所述，益心泰丸可能通過上調PI3K/Akt/GSK-3β信號通路，抑制細胞凋亡，抑制心室重構，從而保護心臟功能。