地黃梓醇對木瓜蛋白酶誘導的大鼠膝骨關節炎模型滑膜組織中S100A12、IL-1β、Galectin-3表達的影響①

何 強 尹 宏 代鳳雷 張 斌 徐 磊

(南京中醫藥大學，南京 210022)

膝骨關節炎是由多種原因導致關節軟骨及軟骨下骨進行性退化，導致生活質量下降及巨大的人力和經濟損失[1，2]。關節軟骨由廣泛的細胞外基質組成，在膝骨關節炎的病變過程中，滑膜組織釋放的促炎因子分解、代謝、活化，導致軟骨細胞外基質凈降解，加速膝骨關節炎進展[3]。膝骨關節炎的癥狀主要表現為疼痛。目前的臨床治療策略效果有限，肌肉的強健和運動沒有得到充分重視，且現有用藥策略副作用較大，尤其是對于老年人群，如乙酰氨基酚的肝毒性、非甾體抗炎藥的胃腸道毒性以及阿片類藥物引起的跌倒、骨折和神經錯亂等[4]。膝骨關節炎的MRI研究已經報道了滑膜炎和疼痛的關系，表明膝骨關節炎疼痛是由炎癥觸發的,意味著抗炎治療策略可能減輕患者疼痛并改善關節功能[5，6]。基于目前用藥策略的毒副作用風險，本研究試圖探討不同濃度的地黃梓醇在膝骨關節炎治療早期能否通過影響滑膜組織中S100A12、IL-1β、Galectin-3表達而發揮作用，探究地黃梓醇治療早期膝骨關節炎的作用機制，為其臨床應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 3～8周齡成年雄性Wistar大鼠40只，由南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供，許可證號：SCXK(蘇)2017-0001，體質量(0.29±0.1)kg。實驗人員均獲得江蘇省動物實驗資格證。實驗方案經南京市六合區人民醫院醫學倫理委員會批準。

1.1.2試劑 Galectin抗體(Proteintech，貨號：14979-I-AP，批號：10006432)；IL-1β抗體(Proteintech，貨號：66737-I-Ig，批號：10006432)；S100A12抗體(Bioworld，貨號：BS7539，批號：XS20181105000)；地黃梓醇(西安明朗科技生物有限公司)；4%木瓜蛋白酶 (上海恒遠生物科技有限公司)；辣根過氧化物酶(Bioworld，貨號：BS10950，批號：CI33171)；辣根過氧化物酶顯色試劑盒(碧云天生物技術有限公司南通分公司，批號：033016160503)；乙醇(成都市科龍化工試劑廠，批號：2015082701)；鹽酸(成都市科龍化工試劑廠，批號：20140706512)；蘇木素(無錫市江源實業技貿總公司，批號：160401100)；中性樹脂(康復器材有限公司，批號：20150710)；石蠟(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20140626)；二甲苯(成都市科龍化工試劑廠，批號：2015072801)。

1.1.3儀器 分析天平(北京塞多利斯科儀器有限公司，型號：BSA124S)；烘箱(上海巴姆測控技術有限公司，型號：101-2AS)；蒸餾水制水器(上海亞榮生化儀器廠，型號：SZ-97A)；超純水機(上海和泰儀器有限公司，型號：Master-D UVF)；石蠟切片機(金華市益迪醫療設備廠，型號：YD-1508A)；光學顯微鏡(蔡司公司，型號：Axioplan 2 imaging)；水浴鍋(鄭州博科儀器設備有限公司，型號：HW-5L)；三維CT(南京中醫藥大學附屬南京中醫院影像學科提供，型號：Siemens Ddfintion AS)。

1.2方法

1.2.1動物分組及造模 大鼠適應性喂養1周，精準稱重，按體質量由小到大順序進行編號，隨機分成4組：正常對照組、模型對照組、地黃梓醇低、高劑量組。除正常對照組外，其他3組造模期間統稱造模組。造模方法參照文獻[7-10]，木瓜蛋白酶法誘導膝骨關節炎，于實驗開始后第1、4、7天分別向大鼠左膝關節腔內注射4%木瓜蛋白酶。注射方法：麻醉前禁食12 h，按大鼠體質量(5 ml/kg)采用體積分數7%的水合氯醛注射于腹腔進行麻醉，大鼠反抗能力減弱即為麻醉顯效。大鼠進入淺麻醉期后，將其身體側臥并伸展左后肢，常規備皮、乙醇消毒，左膝關節屈曲45°,于髕骨下極髕腱外緣處，將4%木瓜蛋白酶100 μl注入大鼠左膝關節腔，誘導大鼠早期膝骨關節炎。見圖1。正常對照組處理方法及注射部位與造模組大鼠相同，左膝關節腔注射等體積生理鹽水。造模第10天，隨機選取造模組和正常對照組大鼠各4只，采用三維CT進行模型鑒定，鑒定過程參考文獻[11]。

圖1 大鼠左膝關節腔注射相應藥物過程Fig.1 Process of injecting corresponding drugs into left knee joint cavityNote:A.Shaving disinfection before injection;B.Injection of medicine into left knee joint;C.After injection.

1.2.2給藥方式 依據《中藥藥理研究方法學》劑量估換計算公式：dB=dA×KB/KA，將推薦成人每天服藥量折算為實驗大鼠每天服藥量[12]。同時結合劉志強等[13]報道的梓醇不同給藥方式藥動學研究制定實驗大鼠每天服藥量及服藥方式。地黃梓醇高劑量組采用100 mg/kg，地黃梓醇低劑量組10 mg/kg，每只大鼠灌胃給予0.2 ml/kg藥物。正常對照組和實驗對照組給予等量生理鹽水。1次/d(早8：00)，連續28 d。

1.2.3標本采集 滑膜組織采集參考文獻[14]。藥物干預完成后，過量麻醉處死大鼠(心臟注射過量7%水合氯醛)，10%強力消毒冷溶液完全浸泡10 min,置于超凈工作臺,仰位并固定,常規消毒。左后肢內側打開左膝關節腔，由髕骨下緣向上延至可見一層平滑光亮呈淡黃色的滑膜組織，完全剝離滑膜組織后完整切下。PBS沖洗干凈后放入一次性塑料包埋框中標記，依順序放入不同濃度梯度的乙醇中脫水2 h；50%乙醇、二甲苯各透明2 h，浸蠟與包埋后切6 μm片，制成玻片后于60℃恒溫烘箱中烘烤約5 h，4℃保存待用。見圖2。

圖2 大鼠膝關節滑膜提取及部分玻片、蠟塊Fig.2 Extraction of synovium of rat knee joint and some slides and wax blocksNote:A.Synovium extracted from knee joint of rats;B.Prepared part;C.Wax block after being made.

1.2.4三維CT觀察 隨機抽取正常對照組和造模組各4只大鼠左膝關節的三維CT影像，以確定造模成功。

1.2.5S100A12、IL-1β、Galectin-3水平檢測 將切片常規二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，3%H2O2滅活切片中的內源性過氧化物酶，放入95℃ 0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中，孵育20 min以上，室溫放置至少20 min；PBS配制5%的正常山羊血清，37℃孵育10 min，甩去多余液體；按說明書采用5%BSA稀釋一抗和二抗，滴加一抗150 μl，室溫靜置1 h，4℃過夜后37℃復溫45 min；PBS洗3次，5 min/次，滴加二抗150 μl，室溫靜置1 h；PBS洗3次，5 min/次，滴加DAB顯色液150 μl，在顯微鏡下掌握染色程度，肉眼可見樣本變成棕黃色；染色程度合適時，立刻用PBS沖洗10 min。常規蘇木素復染，梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。采用Image J軟件統計染色情況，染色陽性采用光密度平均值評價。

2 結果

2.1各組大鼠左膝關節三維CT情況 正常對照組大鼠左膝間隙清晰正常，未見狹窄，關節骨質邊緣光滑平整，造模組大鼠左膝關節間隙明顯變窄，有清晰骨贅生成，骨質邊緣和關節軟骨表面粗糙，見圖3。

圖3 大鼠左膝關節三維CTFig.3 Three dimensional CT of left knee joint of rats

2.2各組大鼠滑膜組織細胞中S100A12、IL-1β、Galectin-3表達情況 正常大鼠滑膜組織細胞質或細胞核中棕褐色顆粒較少，S100A12、IL-1β、Galectin-3無表達。模型對照組大鼠滑膜組織細胞質或細胞核中棕褐色顆粒較對照組明顯增多。地黃梓醇各劑量組大鼠滑膜組織細胞質或細胞核中棕褐色顆粒表達均較模型對照組減少，但地黃梓醇高劑量組較低劑量組減少更為明顯,見圖4。

圖4 各組大鼠滑膜組織細胞中S100A12、IL-1β、Galectin-3顯微鏡下觀察(×200)Fig.4 Observation of S100A12，IL-1β，Galectin-3 in synovial cells of rats in each group under microscope(×200)Note:A.Normal control group;B.Model control group;C.Catalpol low dose group;D.Catalpol high dose group.

2.3免疫組化法檢測各組大鼠滑膜組織中S100A12、IL-1β、Galectin-3表達 正常對照組大鼠滑膜組織中S100A12、IL-1β、Galectin-3水平較低，模型對照組大鼠滑膜組織中S100A12、IL-1β、Galectin-3水平較正常對照組明顯升高(P<0.01)；地黃梓醇低劑量組大鼠滑膜組織中S100A12、IL-1β、Galectin-3水平較模型對照組有所降低(P<0.05)；地黃梓醇高劑量組大鼠滑膜組織中S100A12、IL-1β、Galectin-3水平較模型對照組明顯降低(P<0.01)，見表1。

表1 免疫組化法檢測各組大鼠滑膜組織中IL-1β、Galectin-3、S100A12水平表達Tab.1 Expressions of IL-1β,Galectin-3 and S100A12 in synovium of rats in each group was detected by

3 討論

膝骨關節炎是中老年的常見病和多發病，病理學特征為進行性加重的關節軟骨退化、骨贅形成、軟骨下骨囊腫、關節間隙變窄和關節組織間歇性炎癥反應等[15，16]。膝骨關節炎患者的主訴是反復加重性關節疼痛，嚴重降低患者的日常生活活動能力和生活質量[17]。目前膝骨關節炎的保守治療策略都是基于消炎鎮痛藥的癥狀管理，尚無藥物可影響疾病進展的研究[18]。在膝骨關節炎發病的各種原因中，炎癥是軟骨代謝途徑失衡的最重要因素，導致機體失衡和細胞外基質的降解[19]。此前本課題組圍繞致炎因子與膝骨關節炎、髖骨關節炎的病情進展進行了大量臨床研究[20-22]。

有研究表明炎癥反應可能在膝骨關節炎患者的疼痛發展中起重要作用，局部非甾體類抗炎藥被國際骨關節炎研究協會(OARSI)指南推薦用于所有膝骨關節炎患者[17]。據報道，在安大略省西部和麥克馬斯特大學骨關節炎指數中，滑膜炎與膝關節疼痛嚴重程度密切相關[23,24]。同時，在縱向研究中，Zhang等[25]發現骨髓病變和滑膜炎的變化與膝關節疼痛的波動有關，當骨髓病變較小時疼痛緩解的頻率更高。數據表明，滑膜組織和軟骨下骨受損時可能在確定膝關節疼痛的波動中起關鍵作用。有研究表明滑膜組織中S100A12、IL-1β、Galectin-3 3種致炎因子在早期膝骨關節炎疾病進展過程中起重要作用[26-28]。

本課題組曾研究過膝骨關節炎患者血液及關節外組織中分泌的S100A12進入血液循環后，可到達患者的關節周圍組織，如滑膜，促發滑膜炎；與既往研究類似，S100A12具有炎癥趨化作用，參與滑膜炎癥損傷，進而導致軟骨及關節骨破壞和骨增生；且患者骨關節炎嚴重程度與S100A12的表達呈正相關[21]。本課題組之前研究顯示髖骨關節炎患者具有相同的臨床實驗結果[22]。臨床研究發現IL-1β在膝骨關節炎患者關節軟骨中大量表達[29]。實驗研究發現IL-1β水平越高其骨關節炎嚴重程度越高[30]。有研究表明Galectin-3是關節內炎癥調節劑，可通過促炎作用加速骨關節炎進展[31，32]。同時實驗研究表明Galectin-3水平越高，骨關節炎越嚴重[33]。S100A12在炎癥環境下可驅動膝骨關節炎中IL-1β水平升高[34]。有研究表明Galectin-3是細胞中IL-1β介導的炎癥反應放大器[35]。促炎細胞因子IL-1β表達可影響Galectin-3水平而加速依賴性小梁骨丟失和骨強度降低，加速膝骨關節炎進展[36]。

地黃是傳統四大懷藥之一，熟地黃主歸肝、腎兩經,具有補陰血、益腎精的功效。《本草綱目》中“填骨髓、長肌肉、生精血”的描述肯定了熟地黃對筋骨肌肉虛勞諸證的補益作用。目前熟地黃在臨床上已被廣泛用于炎癥治療[37]。地黃梓醇是從地黃中提取的一種環烯醚萜苷化合物，2015 版《中國藥典》明確規定地黃梓醇作為地黃質量控制的指標[38]。地黃梓醇的藥理作用包括抗細胞凋亡、抗炎等，但缺少相應的基礎研究支持[39]。本實驗通過研究不同濃度地黃梓醇對木瓜蛋白酶誘導的大鼠膝骨關節炎模型滑膜中S100A12、IL-1β、Galectin-3的表達水平，結果表明不同濃度地黃梓醇均能降低膝骨關節炎大鼠滑膜組織中IL-1β、Galectin-3、S100A12表達，且地黃梓醇高劑量組較低劑量組效果更為明顯，地黃梓醇通過抑制早期膝骨關節炎大鼠炎癥因子的釋放阻止軟骨基質降解，延緩膝骨關節炎的進展。

基于本課題組既往臨床試驗研究結果，本次實驗取得了以下新進展：①本次動物實驗結果再次證實炎癥細胞因子S100A12表達與早期膝骨關節炎具有相關性；②實現了從單個炎癥細胞因子S100A12水平的研究到多個炎癥細胞因子S100A12、IL-1β、Galectin-3水平研究；③將傳統中藥地黃應用于實驗研究，并探討地黃梓醇對于早期膝骨關節炎治療的可行性。完善了臨床研究的不足，同時完善了目前地黃臨床應用缺乏相應基礎研究支持的不足。基于以上研究及目前膝骨關節炎治療現狀，課題組將進一步研究以中醫理論“腎主骨”和“治腎亦治骨”為指導，參照《中藥新藥臨床研究指導原則》將膝骨關節炎進行分型，不同證型采用不同中醫經典方劑的臨床研究。本實驗不足之處在于未闡明地黃梓醇膝骨性關節炎治療的最佳濃度及地黃梓醇是否可促進軟骨修復及改善關節生理功能。因此將進一步探究地黃梓醇對早期膝骨關節炎信號通路的影響及以地黃為君藥的方劑臨床研究。