miR-101在口腔鱗狀細胞癌中表達及對細胞增殖與侵襲的影響

楊珊 汪茂青 何科

(1川北醫學院附屬醫院，四川 南充 637000；2成都醫學院附屬第二醫院；3成都市第七人民醫院)

口腔鱗狀細胞癌是一種常見的口腔頜面惡性腫瘤，約占人口腔惡性腫瘤80%以上。遺傳因素、外部環境等相互作用導致了口腔鱗狀細胞癌的發生與發展，主要表現為癌基因的激活與抑癌基因的失活〔1～3〕。miRNA是一類能與靶基因的3′-非翻譯區(UTR)特異性結合的非編碼RNA分子，進而在轉錄水平上調控靶基因表達，參與細胞的生物學行為。目前人體已經發現了超過2 000種的miRNA，miRNA可作為癌基因或者抑癌基因參與腫瘤的發生發展〔4，5〕。miR-101是近期發現的一種在口腔鱗狀細胞癌中低表達的miRNA〔6〕，且研究還發現miR-101與腫瘤細胞的上皮間充質轉分化(EMT)密切相關〔7〕，提示miR-101與腫瘤的侵襲轉移有重要關系。本研究探討miR-101對口腔鱗狀細胞癌KB細胞增殖與侵襲的影響及相關機制。

1 材料和方法

1.1細胞株 KB細胞購于中國科學院細胞庫，培養于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，在37℃，5%CO2條件下培養。

1.2試劑與儀器 DMEM培養基，胎牛血清購于美國Gibco公司；兔抗人鋅指結合蛋白(ZEB)1及GAPDH多克隆抗體購于美國Abcam公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購于南通碧云天生物技術有限公司；重組質粒pmir GLO ZEB1 3′UTR-Wt及pmir GLO ZEB1 3′UTR-Mut購于廣州銳博生物技術有限公司；miR-101 mimics、miR-101NC購于上海吉馬生物技術有限公司；Trizol總RNA提取試劑盒，LipofectamineTM3000脂質體，反轉錄試劑盒(第一鏈cDNA合成試劑盒)購于大連寶生生物技術有限公司；細胞周期試劑盒購于南京凱基生物技術有限公司。Applied Biosystems 7500熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；NanoDrop ND-2000C微量紫外分光光度計購于美國Thermo公司；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統購自美國伯樂公司；Epics-XLⅡ流式細胞儀購于美國Beckman Coulter公司。

1.3細胞轉染 室溫條件下Opti-MEM培養基分別稀釋LipofectamineTM3000、miR-101 mimics及miR-101NC，將Opti-MEM培養基稀釋好的LipofectamineTM3000分別與Opti-MEM培養基稀釋好的miR-101 mimics及miR-101NC混勻，在室溫下放置30 min，使其形成miRNA-LipofectamineTM3000復合物。接著將復合物加入生長融合度達到70%左右的KB細胞中，培養6 h，換新鮮培養液培養至48 h，最后采用Realtime-PCR法檢測細胞中miR-101的表達。

1.4Realtime-PCR法檢測細胞中miR-101表達 按“1.3”轉染KB細胞，收集細胞，并根據Trizol試劑盒說明書提取總RNA，焦碳糖二乙酯(DEPC)水溶解RNA，紫外分光光度計檢測RNA純度及濃度，當檢測出的RNA純度(OD260 nm/OD280 nm=1.8)良好時候，根據反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，反應條件：30℃ 6 min，40℃ 20 min。最后進行 Realtime PCR 分析，預變性95℃，15 min；變性95℃，20 s；退火60℃，34 s；40個循環。用2-△△Ct法分析miR-101表達量。

1.5MTT法檢測細胞活力 將KB細胞平鋪于96孔板，待細胞貼壁后，按“1.3”轉染細胞并培養48 h，加入MTT孵育4 h后去除上清液，每孔細胞中加入150 μl的二甲基亞砜于微量震蕩儀震蕩10 min，于酶標儀560 nm處測定OD值。

1.6細胞克隆形成實驗檢測細胞克隆能力 將KB細胞平鋪于96孔板，待細胞貼壁后，按“1.3”轉染細胞并培養48 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕洗滌2次，加入4%多聚甲醛固定10 min，加入Gimsa染液染色15 min，顯微鏡下觀察。

1.7流式細胞術檢測細胞周期 將KB細胞鋪于6孔板，待細胞貼壁后，按“1.3”轉染培養48 h，每組收集1×106/ml個細胞，按流式細胞周期檢測試劑盒說明書，加入Rnase混勻孵育1 h，再加入碘化丙啶(PI)染液孵育30 min，上流式細胞儀檢測細胞周期。實驗重復3次。

1.8transwell法檢測細胞遷移能力 用DMEM培養液稀釋Matrigel膠，并將稀釋好的Matrigel膠平鋪于8 μm的transwell小室的上室，下室加入10%胎牛血清的培養基。將按“1.3”轉染培養24 h的單細胞懸浮液接種于transwell上室，培養48 h后，取出小室。Transwell上室的細胞用棉簽輕輕擦去，下室用多聚甲醛固定細胞，并用1%結晶紫染色5 min，200倍顯微鏡下觀察穿過濾膜的細胞并計數，取平均值，即為細胞的侵襲數目。實驗重復3次。

1.9Western印跡檢測細胞中ZEB1蛋白的表達 按“1.3”轉染細胞48 h后，收集細胞并加入細胞裂解液在冰上裂解細胞，4℃離心，收集上清液。BCA試劑盒檢測蛋白濃度，取30 ng蛋白樣品上樣，進行12%十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳，轉聚偏二氟乙烯膜40 min。2%的牛血清蛋白(BSA)溶液室溫下孵育1 h，兔抗ZEB1及GAPDH多克隆抗體溶液4℃過夜孵育，第二天室溫孵育二抗，最后根據化學發光免疫試劑盒說明書在凝膠成像系統中曝光各蛋白條帶，并分析條帶灰度值。實驗重復3次。

1.10熒光素酶報告基因表達分析 將miR-101 mimics+ pmir GLO ZEB1 3′UTR-Wt，miR-101 NC+ pmir GLO ZEB1 3′UTR-Wt，miR-101 mimics+ pmir GLO ZEB1 3′UTR-Mut，miR-101 NC+ pmir GLO ZEB1 3′UTR-Mut四組miR-101與ZEB1的重組載體轉入KB細胞中，并根據雙熒光素酶檢測系統檢測每組細胞的熒光素酶活性，計算公式：相對熒光值=螢火蟲熒光素酶熒光值/海腎熒光素酶熒光值。

1.11統計學分析 采用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1miR-101 mimics轉染情況的測定 與miR-101 NC組(0.32±0.03)比較，miR-101 mimics組miR-101表達量(1.45±0.14)顯著上升(P=0.000)。

2.2miR-101對KB細胞活力、細胞克隆形成能力的影響 與miR-101NC組比較，miR-101 mimics組細胞活力顯著降低、細胞克隆數目顯著減少(P=0.000)，見表1。

表1 miR-101 mimics對KB細胞活力、細胞克隆能力的影響

2.3miR-101對KB細胞周期的影響 與miR-101NC組比較，miR-101 mimics組G1期顯著延長，S期和G2期均顯著縮短(P=0.000)。見圖1、表2。

圖1 miR-101對KB細胞周期的影響

表2 miR-101對KB細胞周期的影響

2.4miR-101對KB細胞侵襲能力的影響 與miR-101NC組〔(185.32±18.94)個〕比較，miR-101 mimics組細胞侵襲數目〔(48.73±4.87)個〕顯著減少(P=0.000)。見圖2。

圖2 miR-101對KB細胞侵襲能力的影響(HR，×400)

2.5報告基因分析 miR-101 mimics+ pmir GLO ZEB1 3′UTR-Wt組熒光強度顯著低于其他所有轉染組(P=0.000)。見表3。

表3 報告基因分析

2.6miR-101對KB細胞中ZEB1蛋白及mRNA表達的影響 與miR-101NC組(1.00±0.10、0.43±0.04)比較，miR-101 mimics組ZEB1 mRNA和蛋白表達量(0.25±0.02、0.10±0.01)中顯著下調(P=0.000)。見圖3。

圖3 miR-101對KB細胞中ZEB1蛋白表達的影響

3 討 論

近些年來已發現了2 000多種miRNA，并證實這些miRNA雖然僅僅占人類基因組的1%，卻控制著人類將近30%基因的表達。miR-101是僅存在于脊椎動物中的高度保守的miRNA，存在兩個前體，分別為miR-101-1及miR-101-2，分別定位于人1號和9號染色體中。研究顯示miR-101通過作用于絲氨酸/蘇氨酸激酶(PKC)，進而調控細胞的增殖與分化，還能夠調控依賴PKC的Polycomb抑制復合物2及甲基化的核小體組蛋白的表達水平，進而參與腫瘤的發生發展〔8〕。而且Miao等〔9〕研究表明miR-101基因多態位點(rs578481、rs705509)與口腔鱗狀細胞癌發病風險密切相關。Troiano等〔6〕采用meta分析1 200例來自亞洲的口腔鱗狀細胞癌患者中miRNA的表達，結果表明腫瘤組織中miR-21，miR-455-5p，miiR-155-5p，miR-372，miR-373，miR-29b，miR-1246，miR-196a及miR-181等9個miRNA表達量上調，miR-204，miR-101，miR-32，miR-20a，miR-16，miR-17及miR-125b等7個miRNA表達量下調，且這16個miRNA的差異性表達與患者的總生存率及無病生存率密切相關，提示這些特異性miRNA的表達量能夠預示口腔鱗狀細胞癌患者的預后。本研究說明miR-101 mimics對KB細胞增殖具有抑制作用。腫瘤細胞的無限增殖與細胞周期的不可控制密切相關，miR-101 mimics能顯著抑制KB細胞的侵襲能力。

miRNA主要通過與靶基因mRNAUTR配對結合，進而降解或者抑制靶基因轉錄，調控靶基因轉錄，進而影響細胞的生物學行為〔10～12〕。ZEB蛋白是一種核轉錄因子，包括ZEB1及ZEB2兩個成員。其中ZEB1定位于人10號染色體短臂，可轉錄高達32種的miRNA〔13，14〕。研究顯示ZEB1是EMT重要的調控因子，能促進EMT的發生。另外研究也顯示miR-101與EMT密切相關，miR-101能夠通過調控ZEB1表達抑制肺癌細胞的增殖與轉移，提示ZEB1可能是miR-101的下游靶基因〔7，15〕。本研究說明ZEB1是miR-101下游靶基因，miR-101通過負性調控ZEB1表達進而抑制KB細胞增殖與侵襲。