HPV-DNA及TCT檢測在宮頸癌早期診斷中的應用

楊飛翔 江俊青 羅克鍇 趙 錚

宮頸癌(cervical cancer) 常發生于子宮頸腺上皮部位或鱗狀上皮部位，是臨床最常見的婦科惡性腫瘤之一[1,2]。我國作為宮頸癌高發地區，每年新發宮頸癌病例數約占全球總病例的28%，病死率也約占全世界的1/3[3，4]。目前，宮頸癌篩查方法主要有肉眼觀察法、TCT檢測、HPV-DNA檢測、mRNA檢測、DNA倍體分析、陰道鏡活檢等，TCT檢測對宮頸癌的早期預防和篩查具有一定的意義，其操作簡單，費用低，對于宮頸細胞瘤變具有較高的特異性[5，6]。研究發現HPV病毒持續感染宮頸上皮細胞是宮頸癌發生必要條件，而HPV-DNA對于宮頸癌早期診斷具有較高敏感度[7]。本研究旨在探討TCT、HPV-DNA單一和聯合檢測在宮頸癌早期篩查中的價值及優勢。

對象與方法

1.研究對象：選取2018年1月～2019年12月在湖北醫藥學院附屬東風醫院婦科行宮頸疾病篩查患者作為研究對象，同時行TCT、HPV-DNA和陰道鏡下活檢病例215例，以病理學結果為確診標準，進行回顧性分析。所有入選人員均有性生活，檢查時處于非月經期、非妊娠期、無免疫性疾病及口服免疫抑制劑史、既往無婦科惡性腫瘤診斷史、無子宮切除術和宮頸手術史、無陰道用藥史，年齡為21～70歲的已婚女性。所有患者均簽署知情同意書。

2.主要儀器與試劑：液基細胞學制片分析系統、美國AB公司7500 PCR儀、中高速離心機、潮州凱普HPV基因分型檢測試劑盒等。

3.TCT檢測及評定標準：采集前1天無性生活，標本采集由婦產科醫師進行，采用專用取樣刷于宮頸管內口順時針旋轉5～6圈，將宮頸移行帶區脫落細胞裝入配套的專用保存液中送檢。同時采集兩份，一份做TCT檢測，一份做HPV-DNA檢測。TCT檢測采用2001版國際癌癥協會推薦的TBS系統分級標準進行分級[8]。由兩名病理醫師對結果進行判讀并符合，結果包括未見上皮病變或惡性細胞即nILM；無明確診斷意義的非典型鱗狀細胞即ASCUS；低度鱗狀上皮內病變即LSIL；高度鱗狀上皮內病變即HSIL；癌變包括鱗狀上皮細胞癌(SCC)、不典型腺上皮細胞/腺癌。TCT檢測異常是指ASCUS及以上病變。

4.HPV-DNA分析：采用潮州凱普公司的PCR+膜雜交法檢測HPV核酸，其中高危包括HPV16、18、31、33等共15種，低危包括HPV6、11等共6種。操作步驟及方法按相應試劑說明書進行。PCR反應條件：95℃預變性10min；95℃變性20s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40個循環；最后72℃延伸5min。雜交檢測結果陽性點為清晰可見的藍紫色原點，根據膜條HPV分布圖，判斷HPV結果及其分型。本試劑盒中HPV分型中任一亞型檢測陽性視為患者HPV-DNA檢測結果異常。

5.陰道鏡宮頸組織病理活檢：檢測前1天無性生活，陰道沖洗及上藥，在婦科醫師指導下進行陰道鏡檢查，充分暴露宮頸陰道部、擦凈陰道及宮頸分泌物，使用陰道鏡對可疑部位進行多點取材，如未發現異常則在宮頸3、6、9、12點4處取材，組織標本用1%甲醛溶液固定后送病理學檢測。由高年資病理醫師做最后組織病理學診斷，組織病理學結果包括正常或慢性炎癥、宮頸上皮細胞瘤變(CIN)Ⅰ～Ⅲ級及宮頸癌(浸潤性鱗狀細胞癌、腺癌、其他宮頸細胞癌)。組織學陽性指高級別宮頸上皮細胞瘤變，即≥宮頸上皮內瘤變CINⅡ者為陽性。組織學陰性指正常、慢性炎癥、尖銳濕疣、CINⅠ。

6.統計學方法：采用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行統計分析，計數資料計算百分比(%)，組間比較采用χ2進行分析，計算敏感度、特異性、陰性預測率值、陽性預測值率，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.HPV-DNA、TCT檢測及宮頸組織病理結果分析:12685例HPV-DNA檢測，其中1139例HPV-DNA陽性，陽性率為8.98%。同時行HPV-DNA、TCT檢測及陰道鏡下宮頸組織細胞活檢患者215例，TCT檢測異常169例，占78.60%，其中ASCUS 109例，LSIL 22例，HSIL 37例，SCC 1例；HPV-DNA檢測陽性患者156例，占72.56%(156/215)，其中ASCUS 57例，LSIL 18例，HSIL 34例，SCC 1例。HPV陽性組與HPV陰性組對于CINⅡ及以上的檢出率分別為31.41%(49/156)和10.17%(6/59)，二者比較差異有統計學意義(χ2=10.145，P=0.001)。HPV-DNA陽性在正常或炎癥組、CINⅠ組、CIN Ⅱ/Ⅲ組、宮頸癌組中組織學陽性檢出率分別為55.79%(53/95)、83.08%(54/65)、88.00%(44/50)、100.0%(5/5)，隨著宮頸細胞瘤變及細胞學異常級別的增加，HPV陽性率也逐漸增加，同樣HPV-DNA陽性率隨著宮頸細胞學異常程度的增加而升高，ASCUS、LSIL、HSIL、SCC組中HPV-DNA陽性率分別為52.29%(57/109)、81.82%(18/22)、91.89%(34/37)、100%(1/1)，詳見表1、表2。215例患者中，TCT異常169例，占78.60%(169/215)，TCT≥HSIL對于CINⅡ及以上的檢出率為76.32%(29/38)，顯著高于TCT

表1 HPV-DNA及TCT檢測及宮頸組織活檢結果

表2 215例患者HPV-DNA、TCT檢測及聯合檢測與組織病理活檢結果分析[n(%)]

2.單一HPV-DNA及TCT檢測與兩者聯合檢測診斷效果比較：以宮頸病理組織活檢為診斷標準， HPV-DNA檢測陽性對于預測CIN Ⅱ及以上病變結果預測的敏感度、特異性、陰性預測值及陽性預測值分別為89.09%、33.13%、89.83%和31.41%，TCT≥HSIL對于預測CIN Ⅱ及以上病理結果的敏感度、特異性、陰性預測值及陽性預測值分別為52.73%、94.38%、85.31%和76.32%。為提高其敏感度，降低漏診率，采取并聯試驗，即TCT檢測和HPV-DNA檢測中任一為陽性即判定為陽性，二者聯合檢測應用于預測高級別宮頸癌病變的敏感度、特異性、陰性預測值及陽性預測值分別為92.73%、32.50%、92.86%和46.79%，詳見表3。

表3 TCT、HPV-DNA及聯合檢測對CINⅡ及以上宮頸病變的診斷效果比較

討 論

宮頸癌嚴重威脅發展中國家女性健康，其發生率居女性惡性腫瘤第4位，我國每年大約有15萬宮頸癌新發病例[9，10]。宮頸癌的發生起源于宮頸上皮細胞異常增生，而宮頸癌早期無明顯臨床指征，易造成漏診，因此，篩查識別出宮頸癌高危人群，對于患者科學預防和治療至關重要。現階段，陰道鏡下宮頸組織活檢是診斷宮頸上皮細胞瘤變的金標準，具有很高的準確率，但其屬于有創操作，患者接受度低，因此，探索一種高敏感度、無創的宮頸癌早期篩查方法具有重要價值。

TCT檢查具有操作簡單、費用低廉、特異性高等優點被廣泛應用到臨床宮頸癌篩查中。本研究中單一TCT檢測對于宮頸CIN Ⅱ及以上病變的敏感度為52.73%，特異性為94.38%，與文獻報告基本一致[11，12]。TCT異常在不同宮頸病理組織中均具有較高的檢出率，在LSIL、HSIL及SCC與宮頸癌的病理活檢結果的符合率分別為40.91%(9/22)、75.68%(28/37)和100%(1/1)，提示TCT檢測對宮頸細胞瘤變具有較高的診斷準確率，隨著宮頸細胞瘤變程度升高TCT檢測正確率增高。同樣，其也存在一定的漏診，在CINⅡ/Ⅲ和宮頸癌組中，其假陰性率分別為48.00%(24/50)和40.00%(2/5)，這可能與臨床醫生取材、病理技師制片效果有一定影響[13,14]。因此，規范化采集及病理制片培訓和考核對于宮頸癌癌前病變的檢出尤為重要。

生殖道HPV持續感染是宮頸上皮細胞瘤變、宮頸癌發生的必然條件[15,16]。宮頸細胞瘤變患者中80%～90%伴有HPV 感染，通常認為大多數年輕女性感染HPV是一過性的，會隨著時間的推移自然清除，僅5%～10%發展為持續感染。在本研究中215例患者中，HPV-DNA陽性檢出率為72.56%，HPV-DNA陽性對于CIN Ⅱ及以上的檢出率顯著高于HPV-DNA陰性病例檢出率，且隨著瘤變級別的增加，HPV陽性率也逐漸升高，因此，對于宮頸癌早期篩查患者，HPV-DNA陽性結果可有效地篩選出高級別宮頸細胞瘤變及宮頸癌病變。需要注意的是在高級別宮頸上皮細胞瘤變病例中，也有少量HPV陰性病歷，這可能與檢測試劑盒檢測范圍的局限性有關，也可能與宮頸脫落細胞取材有關，因此，對于HPV-DNA檢出陰性者，美國陰道鏡和宮頸病理學會指出對于年齡在30～65歲HPV核酸檢測陰性女性，應間隔1年定期復查HPV-DNA檢測。在宮頸癌早期篩查中，HPV-DNA檢測具有較高的敏感度。本研究中，以宮頸病理組織活檢為標準，HPV-DNA及TCT單一檢測對于預測CIN Ⅱ及以上病理結果的敏感度分別為89.09%和52.73%，特異性為33.13%和94.38%，二者聯合檢測對于預測高級別宮頸癌病變的敏感度、特異性、陰性預測值以及陽性預測值分別為92.73%、32.50%、92.86%和46.79%。二者聯合檢測，可以有效提高對于高級別宮頸細胞瘤變檢出的敏感度和陰性預測值，提高對高級別宮頸細胞瘤變診斷的敏感度，減少宮頸疾病篩查患者中高級別瘤變的漏診，也可以減少不必要的陰道鏡下活檢等有創操作。

本研究中HPV-DNA與TCT聯合檢測可有效提高對宮頸癌癌前病變的檢出率，提高對高級別宮頸細胞瘤變檢出的敏感度，但是其檢測特異性降低。這主要是因為診斷試驗方法學評價中敏感度和特異性是一對矛盾體，二者不可兼得。前期研究血清SCC與HPV-DNA檢測在非典型鱗狀上皮細胞診斷的意義中，同樣發現二者聯合檢測可有效提高CINⅡ以上宮頸細胞瘤變的敏感度，但其特異性降低[16]。本研究主要通過二者聯合檢測提高對宮頸癌癌前病變的檢出率，提高宮頸癌癌前病變早期診斷的效率，但會犧牲一定的特異性，造成少數被誤判而做宮頸組織活檢，經病理診斷為無明顯異常的假陽性病例。與更早的診斷宮頸癌癌前病變及預測宮頸癌發展趨勢比較，只要將陰道鏡下活檢控制在可能小的范圍內，付出這種代價應該是允許的。

綜上所述，單一HPV-DNA或TCT檢測對于宮頸癌早期病變篩查具有重要作用，兩者聯合檢測可有效提高CIN Ⅱ及以上病變的敏感度，減少宮頸高級別病變的漏診，能在早期有效篩選出高級別宮頸上皮細胞病變。隨著宮頸細胞標志物如HPV E6/E7 mRNA、has miRNA、p53、Ki67、TOP2A/MCM2、甲基化等分子、細胞因子的進一步研究，相信其聯合常規HPV-DNA和TCT檢測對于宮頸癌早期診斷具有重要的價值[17,18]。明確單一TCT、HPV-DNA檢測及二者聯合檢測在評價在宮頸癌早期診斷中的優勢，探索宮頸癌早期分流診斷的標準化模式，尋找最適合臨床應用的篩查方案，為臨床早期篩查和診斷宮頸細胞病變提供科學依據。