一種建立骨腫瘤肺轉移模型的方法研究

白磊鵬 呂家興 李哲宏 孔令偉 曹海營 金 宇

骨與軟組織肉瘤均來源于間葉組織，其轉移方式幾乎都是血道擴散，肺因為雙重血供的特殊解剖結構，是骨與軟組織肉瘤早期轉移的好發部位[1, 2]。惡性骨腫瘤肺轉移率高達1%～9%，高度惡性的骨原發性肉瘤患者在確診時15%～20%肺部有微小轉移病灶[3, 4]。臨床中對于骨與軟組織肉瘤的治療，尤其是出現肺轉移的患者，需要多學科聯合治療，延長生存時間，但此類患者的預后都較差[5]。由于骨與軟組織肉瘤發生肺轉移的患者病情十分復雜，涉及多個系統，在基礎實驗中缺乏理想的骨腫瘤肺轉移動物模型，導致骨腫瘤肺轉移的相關研究較少見。因此，建立一種穩定的惡性骨腫瘤的肺轉移動物模型對于研究其發生機制、生物學特性、治療方法等具有十分重要的意義。

目前，骨腫瘤常用的動物模型有小鼠模型、裸鼠模型等，而大型哺乳類動物模型常用兔VX2骨腫瘤模型[6～8]。理想的惡性骨腫瘤的肺轉移模型應與人類的肺轉移發生的機制相同或接近，在局部浸潤、轉移方式等方面具有代表性，且對于肺部的觀察簡便易行。VX2腫瘤細胞是由Shope病毒誘導的人乳頭瘤來源的鱗狀細胞癌，經過72代移植后形成[9]。大量研究表明，兔VX2肝腫瘤生長迅速，可以接種到肺、肝、肌肉或骨骼[10]。VX2兔骨腫瘤模型具有人類惡性骨腫瘤類似生物學特性，可用于模擬人骨腫瘤的增殖和轉移過程[11]。因此，本研究選擇在制作兔VX2骨腫瘤動物模型的基礎上，探究一種建立骨腫瘤肺轉移的動物模型的方法，以精準地體現骨腫瘤肺轉移的發生、發展過程，可以更好地了解其生物學特性，為今后的相關研究提供參考。

材料與方法

1.動物和瘤株:普通級日本大耳白兔31只，雌雄不限，月齡2.5個月，體質量2.0～2.5kg。購自北京市昌揚西山養殖場，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0007。所有實驗兔喂養環境溫度為25℃，濕度為50%。維持12/12h的光/暗周期，室內通風良好，食物和水的獲取受到限制(每天2次)。VX2腫瘤細胞株購自重慶蒙博生物科技有限公司，實驗地點為承德醫學院附屬醫院中心實驗室。本研究遵循承德醫學院實驗動物保護和使用要求，遵循醫學倫理學要求。

2.VX2腫瘤組織塊的制備：在常溫常壓環境中，由兩名實驗員將VX2腫瘤細胞組織植入1只日本大耳白兔左大腿肌肉處。3周后，腫瘤生長至3cm×3cm×3cm腫塊。經耳緣靜脈注射1%戊巴比妥鈉(35mg/kg)麻醉，以兔角膜反射消失為麻醉成功標志。去除腫瘤區兔毛，俯臥位固定于動物實驗操作臺上，碘伏消毒術區，鋪蓋無菌孔巾，切開皮膚，分離皮下組織、腫瘤。將腫瘤完整取出后移至無菌工作臺上，置于37℃的PBS中清洗3遍，去除腫瘤中血跡、壞死組織和纖維組織，眼科剪將腫瘤剪成1mm×1mm×1mm的組織塊，置于含10%的胎牛血清中，常溫常壓下臨時存放備用。

3.VX2骨腫瘤模型的制作:30只日本大耳白兔術前4h禁食水，經耳緣靜脈注射1%戊巴比妥鈉(35mg/kg)麻醉，后肢備皮仰臥位固定于操作臺上，碘伏消毒3遍后鋪無菌孔單。選取左側膝關節內側皮膚做一1cm長切口，逐層切開皮下組織和筋膜，暴露髕韌帶，縱行鈍性分離髕韌帶，顯露脛骨平臺，在脛骨平臺面用1mm克氏針鉆孔，用頂棒將體積為1mm3的VX2腫瘤組織塊沿套管推入脛骨髓腔內，拔出套管，骨蠟封堵骨孔，無水乙醇沖洗骨孔周圍組織3遍，每次保留無水乙醇浸泡1min以上，兩側髕韌帶縫合重建后，逐層縫合切口,模型制作完成。縫合后連續3天大腿肌內注射青鏈霉素混懸液預防感染，模型制作完成。以上操作于中心實驗室動物實驗間完成，實驗間設備及環境由專業人員定時清理消毒。

4.局部轉移和肺轉移的觀察：在建模完成后，每周對左側脛骨進行1次X線檢查，連續2周。由高年資骨腫瘤臨床醫生做出評估，腫瘤生長速度，骨皮質破壞及局部轉移顯影情況與臨床患者表現差異。第1周隨機選取15只家兔1%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉后經耳緣靜脈空氣栓塞處死，解剖獲取肺臟大體病理標本，由病理科醫生進行固定、包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色。鏡下觀察VX2腫瘤在肺組織中表現與周圍正常組織的關系。第2周同樣方法處死剩余家兔后取材后經HE染色鏡檢。取材操作于中心實驗室動物實驗間完成，HE染色及鏡檢由醫院病理科醫生于病理實驗室完成。

結 果

30只家兔肺中均出現腫瘤組織，建模成功率100%。30只家兔第1周脛骨X線顯示腫瘤在髓內生長迅速，出現骨膜反應；第2周3只家兔腫瘤浸潤至骨外。大體解剖可見，第1周，15只家兔全部可在肺部見多發腫瘤結節，主要分布在肺部邊緣處，從肺邊緣向肺門逐漸減少；第2周，15只家兔全部肺部布滿腫瘤結節，明顯多于第1周。HE染色鏡下，腫瘤細胞在肺臟中聚集成巢，結節中心為壞死細胞，周圍為核大深染的腫瘤細胞和炎性細胞，腫瘤細胞與正常肺組織間邊界不清晰(圖1)。

討 論

骨與軟組織肉瘤是來源于骨骼、肌肉、脂肪、血管及纖維結締組織等間葉組織的惡性腫瘤，肺是骨與軟組織肉瘤最常見的轉移部位[12, 13]。骨與軟組織肉瘤早期幾乎全部經血源性擴散轉移到肺部。據相關報道，15%～20%的骨與軟組織肉瘤患者會發生遠處轉移，其中肺轉移者可達90%[14, 15]。發生肺轉移的惡性骨腫瘤患者的預后極差，這種結果一方面是由于惡性腫瘤復雜的生物學特性引起的，另一方面顯示了目前對于惡性骨腫瘤的遠處轉移的研究不足[16]。

圖1 骨腫瘤肺轉移模型的制作和檢測A.經脛骨種植VX2腫瘤；B.第1周X線示腫瘤在髓腔內生長，破壞骨皮質；C.第2周X線示腫瘤浸潤至骨外；D.第1周，肺轉移結節分布從肺邊緣至肺門逐漸減少；E.第2周，P肺轉移結節布滿全肺；F.鏡下正常肺組織(HE,×40)；G.第1周肺組織腫瘤結節(HE,×40)；H.第2周肺組織腫瘤結節(HE,×40)

目前，臨床中治療骨與軟組織肉瘤肺轉移的方法主要有外科手術切除、局部消融、放療、化療、分子靶向治療以及最新興起的免疫治療等[17]。這些治療大多具有良好的近期效果，但是遠期療效尚未有明顯的改善。因此，建立符合人類骨與軟組織肉瘤肺轉移的動物模型可以精準地體現腫瘤在病患體內的發生、發展過程，可以更好地了解腫瘤肺轉移的生物學特性，對于制定個體化治療方案及腫瘤肺轉移的基礎和臨床研究具有重要意義。理想的骨與軟組織肉瘤肺轉移模型，應與人類的肺轉移過程具有相同或相近的生物學行為，在局部擴散、遠處轉移、肺部浸潤等方面提供臨床研究價值。研究表明，兔VX2腫瘤生長迅速，可以接種至骨骼制成惡性骨腫瘤動物模型。同時，VX2腫瘤細胞轉移到肺部后可以早期產生淋巴結轉移[11, 18]。這表明VX2兔骨腫瘤模型具有相關生物學特性，可用于模擬人轉移性骨腫瘤。

兔脛骨VX2骨腫瘤肺轉移動物模型的優點：①操作簡便，時間短；②創傷小；③肺部無損傷；④自發轉移過程符合腫瘤特性；⑤成模率高。以往的肺部植瘤模型，需要根據肺部解剖對植瘤部位和方式進行嚴密操作，植瘤術后并發癥高，易造成動物死亡。而兔脛骨VX2骨腫瘤肺轉移模型不需要對肺部進行操作，只需在脛骨植入腫瘤，隨著腫瘤的自發轉移過程，1周即可獲得肺轉移瘤模型，其操作步驟十分簡單，手術創傷也僅在脛骨植瘤部位留下1cm左右的切口，手術不會對肺部造成損傷。腫瘤肺轉移的過程是腫瘤生物學特性的表現，避免了肺部植瘤的手術干擾因素。更小的創傷使得動物更易耐受手術操作，降低了動物的死亡率，因此成模率極高，本實驗中，30只家兔全部建模成功，已證明了這一點。對植瘤的脛骨X線檢查發現，在第1周時，腫瘤在髓腔內迅速生長，并且出現骨膜反應；第2周時，部分家兔脛骨中腫瘤已浸潤至骨外，擴散到周圍軟組織中。通過大體解剖發現，在第1周時，盡管腫瘤還在髓腔內生長，但是肺部已經出現肺緣分布的腫瘤結節，而第2周時，腫瘤基本上布滿全肺。病理切片鏡下觀察，可見肺組織中成團落聚集的腫瘤結節，HE 染色中心區域為壞死細胞，呈嗜堿性紅染，外周表現為濃染的腫瘤細胞、結締組織和炎性細胞，這與以往研究中的VX2腫瘤細胞的鏡下表現相同[19]。

總結本方法建模的經驗：①簡化操作，減小創傷，可以極大提高動物植瘤后的成活率；②通過向脛骨內植入較大的腫瘤組織塊，可以加速腫瘤生長，更快獲得肺轉移模型；③通過脛骨植瘤的肺轉移模型，可以避免種植瘤的局部浸潤影響對遠處轉移的觀察；④腫瘤的遠處轉移是一個動態的過程，該生物學行為在植瘤后第1周內即可發生。

綜上所述，本研究采用經脛骨移植VX2腫瘤組織塊，建立兔脛骨骨腫瘤模型，腫瘤在脛骨髓腔內生長至一定程度后發生遠處轉移，形成肺轉移瘤模型，該方法避免了肺部的損傷，保留了肺部的完整結構，且獲得的病理標本均為多發的肺腫瘤結節，這與臨床中肺轉移瘤的特性相同，可以較為真實地研究惡性骨腫瘤肺轉移的生物學行為[20]。該模型制作方法簡單，成功率高，在構建途徑、生長方式和病理上均接近于人類惡性骨腫瘤肺轉移過程，能全面表現腫瘤浸潤、轉移全過程，值得在基礎研究中推廣。

本研究的不足之處在于缺乏肺部完整的影像學資料。VX2腫瘤細胞雖然是基礎研究較為成熟的造模瘤株，但惡性骨腫瘤多為間葉組織來源，而VX2腫瘤細胞是鱗狀細胞癌，其生物學特性與惡性骨腫瘤比較，仍存在許多差異，因此本研究僅對制作骨腫瘤肺轉移模型的方法具有一定的參考價值，而對于惡性骨腫瘤的肺轉移參考價值有限。