農(nóng)桿菌介導(dǎo)棉花遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素

李靜　張換樣　朱永紅　吳慎杰　焦改麗

摘? ?要? ?分析了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素：棉花基因型是影響體細胞胚胎發(fā)生的關(guān)鍵因素;培養(yǎng)1周且分化不成熟的棉花下胚軸是誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的首選外植體;高比值的KT/2，4-D可有效誘導(dǎo)胚性愈傷組織的產(chǎn)生，低比值則可以促進體細胞胚胎發(fā)生;葡萄糖比麥芽糖更適合誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。在轉(zhuǎn)化過程中，胚性愈傷是農(nóng)桿菌侵染較合適的原始轉(zhuǎn)化材料;菌液的培養(yǎng)溫度、濃度、侵染時間及乙酰丁香酮（AS）濃度都會影響組織的轉(zhuǎn)化效率;合適的抗生素濃度也是抗性愈傷篩選的必要保證。

關(guān)鍵詞? ?棉花;農(nóng)桿菌介導(dǎo)法;遺傳轉(zhuǎn)化;誘導(dǎo)培養(yǎng);影響因素

中圖分類號：S562? ? 文獻標(biāo)志碼：C? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.22.002

棉花（Gossypium spp）是世界上最重要的經(jīng)濟作物之一，在全球經(jīng)濟中扮演重要角色，棉花纖維是紡織業(yè)的重要原料，棉稈和棉籽等都可以用作生物質(zhì)能源原料。棉花屬于錦葵科（Malvaceae）棉花屬（Gossypium），該屬有超過50個種，廣泛栽培的有4個種，其中陸地棉（Gossypium hirsutum L.）的種植面積超過全球棉花種植面積的90%。雖然傳統(tǒng)育種技術(shù)在提高棉花產(chǎn)量、纖維品質(zhì)、棉籽油品質(zhì)和高溫耐受能力等方面取得了較大的成功，但常規(guī)育種方法得到的棉花品種不同程度地存在種子活力低、易受蟲害草害影響、生長發(fā)育偏慢、易發(fā)生莖枯病等問題。轉(zhuǎn)基因方法可以通過直接或間接轉(zhuǎn)化手段，有目的地向棉花體內(nèi)引入控制性狀遺傳的優(yōu)良基因，實現(xiàn)生物性狀的定向改變，從而提高棉花產(chǎn)量，改良纖維品質(zhì)，增強植株抗蟲、抗除草劑、抗病能力和抗逆性。

1987年，Umbeck、Firoozabady等先后報道了通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPTII）作為選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)入珂字棉312和珂字棉210[1-2]。隨后農(nóng)桿菌介導(dǎo)的體細胞胚發(fā)生轉(zhuǎn)化法成為國際上普遍使用的棉花轉(zhuǎn)化手段。傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法常用下胚軸或子葉作為受體，從共培養(yǎng)開始，在選擇培養(yǎng)基上產(chǎn)生數(shù)百個獨立轉(zhuǎn)化事件的愈傷組織，愈傷組織經(jīng)過胚胎誘導(dǎo)及體細胞胚向正常植株發(fā)育和萌發(fā)，最終長成再生植株，這種多步驟的轉(zhuǎn)化周期較長（一般為10～12個月），轉(zhuǎn)化效率較低。

近年來，不少研究發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織作為受體感染農(nóng)桿菌時，恢復(fù)自身正常生長和存活需要更少的時間，縮短了整體培育周期，轉(zhuǎn)化效率更高[3-4]。與下胚軸和子葉相比，胚性愈傷組織可能是更好的原始轉(zhuǎn)化材料。這種方法與其他棉花轉(zhuǎn)化方法相比，更加簡單、可靠和高效，省時省力。

本文主要從以下兩方面分析通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染獲得再生植株的影響因素：愈傷組織誘導(dǎo)和體細胞胚胎發(fā)生的影響因素;農(nóng)桿菌介導(dǎo)愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素。

1 愈傷組織誘導(dǎo)和體細胞胚胎發(fā)生的影響因素

體細胞胚胎發(fā)生是體細胞被重新編程發(fā)育成類似受精卵形成的胚胎的過程。體細胞胚胎發(fā)生有直接發(fā)生、間接發(fā)生兩種形式。在直接發(fā)生方式中，外植體的單個細胞直接發(fā)育成胚的類似物;間接發(fā)生方式中，體細胞胚的形成要經(jīng)過一個脫分化過程形成愈傷組織。1979年，Price和Smith[5]首次報道了從克勞茨基棉花的細胞懸浮培養(yǎng)中獲得了體細胞胚。1983年，Davidonis、Hamilton[6]首次從陸地棉中獲得完整的再生植株。棉花體細胞胚胎是獲得完整轉(zhuǎn)基因植株的關(guān)鍵，這個過程較為復(fù)雜，受細胞內(nèi)、外多種因素影響，主要包括內(nèi)在因素（植物基因型、外植體類型等）和外在因素（培養(yǎng)基成分、外源生長調(diào)節(jié)因子等）。

1.1 內(nèi)在因素

1.1.1 基因型

基因型是影響體細胞胚胎發(fā)生的主要因素[7]，影響體細胞胚胎發(fā)生的其他因素都取決于棉花基因型。眾多研究表明，不同棉種、同一棉種不同品種的胚胎發(fā)生和植株再生能力差異很大，在誘導(dǎo)體細胞胚時所需用的生長調(diào)節(jié)劑濃度和培養(yǎng)條件等差別也很大[8]。為了研究基因型對體細胞胚胎發(fā)生的影響，Trolinder將38個栽培種分別用4種生長調(diào)節(jié)劑組合方式處理，在所有生長調(diào)節(jié)劑處理中珂字312的胚胎發(fā)生率最高，隨后是珂字304、珂字315和珂字310，其余基因型在所有生長條件下的胚胎發(fā)生能力較差[9-10]。目前國內(nèi)外許多實驗室均從珂字棉得到了較多的再生植株，珂字棉已成為棉花組織培養(yǎng)的模式品種，廣泛應(yīng)用于棉花組織培養(yǎng)及其遺傳轉(zhuǎn)化等研究中。也有一些研究發(fā)現(xiàn)非珂字棉品系如岱字棉[11]、中國培育品種YZ-1[12]的胚胎發(fā)生率也很高。

在四大栽培種中，陸地棉體細胞胚胎發(fā)生較易，亞洲棉次之，海島棉和非洲棉較差[13]。棉花體細胞胚胎發(fā)生和植株再生是一種受多基因控制的遺傳特性，選育新品種時可以珂字棉為親本進行系統(tǒng)或雜交選育，將這些基因傳遞給育出的新品種，這樣就會保留住親本中的體細胞胚胎發(fā)生能力和植株再生能力[14]。

1.1.2 外植體

成熟組織（莖、葉、根、葉柄）和非成熟組織（子葉、下胚軸、地上分生組織）都可作為外植體誘導(dǎo)體細胞胚胎生成[15]。一般而言，內(nèi)源生長素含量較多的外植體更易生成胚胎[16]，不成熟的外植體可能由于含有較高水平的內(nèi)源生長素而比成熟組織擁有更強的胚胎發(fā)生能力。Trolinder和Goodin以生長3 d的珂字棉312為材料，比較了多種外植體胚胎發(fā)生能力，結(jié)果表明下胚軸最易誘導(dǎo)體細胞胚胎發(fā)生，中胚軸和上胚軸次之，種子和子葉較差，葉片和莖段最差。Sakhanokho等研究也發(fā)現(xiàn)下胚軸比子葉更易誘導(dǎo)胚胎發(fā)生，并首次用下胚軸和子葉培養(yǎng)出海島棉（G.barbadense L.）的再生植株[17]。子葉下胚軸作為外植體要比子葉所需的培養(yǎng)時間短，并且可阻止無性系變異的發(fā)生[18]。另外，下胚軸最易誘導(dǎo)出優(yōu)良的愈傷組織[19]。很多研究者都是利用3日齡或6日齡的棉花無菌苗的下胚軸，切成3～5 mm的小塊進行愈傷組織的誘導(dǎo)。建議在棉花組培過程中最好選用無菌苗的下胚軸作為外植體。

1.2 外在因素

1.2.1 培養(yǎng)基組成和植物生長調(diào)節(jié)劑

高質(zhì)量愈傷組織的形成是再生出完整棉花植株的關(guān)鍵因素，其中生長調(diào)節(jié)劑是最重要的影響因子。高比值的細胞分裂素/生長素可有效誘導(dǎo)胚性愈傷組織的產(chǎn)生。在幾個棉花品種中，2，4-D和NAA是更加有效的生長素類似物，雖然二者在誘導(dǎo)胚胎發(fā)生過程當(dāng)中并無本質(zhì)區(qū)別，但2，4-D可以更快速地誘導(dǎo)胚胎發(fā)生。2，4-D抑制胚性愈傷組織分化為胚狀體，因此在胚狀體生長的培養(yǎng)基中一般要去除2，4-D。所有細胞分裂素中，2iP和 KT在誘導(dǎo)胚胎發(fā)生中效果尤為顯著，2iP、KT分別與2，4-D共同使用時胚胎發(fā)生率可達到41.9%、23.5%。2，4-D+KT組合是棉花組織培養(yǎng)中的常用植物生長調(diào)節(jié)劑組合，廣泛用于棉花愈傷組織的誘導(dǎo)和體細胞胚胎發(fā)生中[20]。還有其他植物生長調(diào)節(jié)劑組合也被成功應(yīng)用于不同棉花品種的體細胞胚胎發(fā)生，其中IBA+KT組合通常用來繼代培養(yǎng)胚性愈傷組織和促進體細胞胚胎發(fā)生，近年來也被成功應(yīng)用于愈傷組織的誘導(dǎo)和分化調(diào)控[21]。

此外，還有一些其他生長調(diào)節(jié)劑，如IBA和IAA也是愈傷組織誘導(dǎo)時常用的生長素類似物，但之后需用NAA替換才能形成胚胎[22-23]。用子葉下胚軸作外植體可在以毒莠定為生長素源的培養(yǎng)基上獲得胚性愈傷組織。Benzyl amino purine （BAP）和2，4-D共同作用也可有效誘導(dǎo)胚性愈傷組織的形成[24]。也有報道稱只有兩種細胞分裂素而無生長素或只有兩種生長素類似物而無細胞分裂素的組合也可以誘導(dǎo)胚胎發(fā)生[25]。在所有方法中，Trolinder等、Firoozabady等采用的生長調(diào)節(jié)劑組合（0.1 mg·L-1 2，4-D+0.1 mg·L-1 KT，5.0 mg·L-1 2iP+0.1 mg·L-1 NAA）對于多種栽培種均可以獲得疏松的愈傷組織。大多數(shù)研究者在這兩種方法的基礎(chǔ)上依據(jù)培養(yǎng)條件和基因型，調(diào)整生長調(diào)節(jié)劑濃度來獲得胚性愈傷組織[26]。

1.2.2 碳源

碳源也是影響棉花愈傷組織誘導(dǎo)和體細胞胚形成的一個重要因素，難再生的棉花品種只能在某一特定的培養(yǎng)基里再生。在愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖中最常用的是MSB培養(yǎng)基，即MS培養(yǎng)基的無機鹽與B5培養(yǎng)基的有機成分相配合的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基的碳源選擇上，棉花愈傷組織誘導(dǎo)宜用葡萄糖作為碳源，而胚性愈傷組織增殖、保存和胚狀體的萌發(fā)過程宜使用麥芽糖作碳源[27]，也有試驗表明4%的葡萄糖是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳選擇。

2 農(nóng)桿菌侵染胚性愈傷組織的影響因素

傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法常用下胚軸或子葉作為受體，通過體細胞胚胎發(fā)生技術(shù)獲得再生植株。Wu等在培育抗蟲轉(zhuǎn)基因棉時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化愈傷組織比轉(zhuǎn)化其他外植體（下胚軸、子葉）可減少6個月的時間。另外，胚性愈傷組織作為外植體時，Southern雜交分析表明大約有15%的轉(zhuǎn)化效率，平均每個培養(yǎng)皿能鑒定出8～12個陽性苗。Wu等采用該方法在短時間內(nèi)每個愈傷組織獲得30～100個植株，GUS染色陽性率為72.60%[28]。因此，與子葉下胚軸或子葉相比，胚性愈傷組織可能是最好的原始轉(zhuǎn)化材料。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功運用主要依賴以下幾個因素：農(nóng)桿菌將基因轉(zhuǎn)入特定基因組的轉(zhuǎn)化能力;轉(zhuǎn)化細胞的再生能力。這兩個因素又依賴于其他幾個影響因子，如基因型、外植體、農(nóng)桿菌種類、乙酰丁香酮濃度等。

2.1 農(nóng)桿菌菌株

農(nóng)桿菌菌株對轉(zhuǎn)化效率影響很大。Sunilkumar和Rathore等用農(nóng)桿菌侵染陸地棉子葉圓盤發(fā)現(xiàn)LBA4404的轉(zhuǎn)化效率明顯高于EHA105[29]。Tohidfar等用LBA4404、EHA101和C58侵染子葉和下胚軸時，LBA4404的轉(zhuǎn)化效率最高[30]。Leelavathi等、Wu等都利用農(nóng)桿菌LBA4404侵染陸地棉胚性愈傷組織獲得轉(zhuǎn)基因棉。Jin等在轉(zhuǎn)化陸地棉胚性愈傷組織過程中也發(fā)現(xiàn)LBA4404的轉(zhuǎn)化效率遠高于C58C3。桿菌菌株如 AGL1、GV3111、GV3101也被用于轉(zhuǎn)基因棉的培養(yǎng)[31]。轉(zhuǎn)化陸地棉時推薦使用LBA4404菌株，轉(zhuǎn)化效率較高。

2.2 乙酰丁香酮（AS）

AS是受傷的植物組織分泌的酚類化合物，它能夠誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒中一系列Vir基因的表達[32]，這對于T-DNA的轉(zhuǎn)移是必須的。Sunilkumar等首次在棉花轉(zhuǎn)化時的農(nóng)桿菌生長階段和共培養(yǎng)階段添加100 μM的AS，發(fā)現(xiàn)可以顯著提高珂字棉312和其他3個栽培種（TAM-94L25、TAM-89E51、TAM-94WE37S）的轉(zhuǎn)化效率[33]。Jin等在轉(zhuǎn)化胚性愈傷組織時設(shè)置了不同的AS濃度梯度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在50 mg·L-1（250 μM）時可顯著提高轉(zhuǎn)化效率;當(dāng)AS濃度達到100 mg·L-1（500 μM）時，轉(zhuǎn)化效率降低[34]。Wu等在轉(zhuǎn)化時添加0、25、50、75 mg·L-1的AS，發(fā)現(xiàn)AS濃度為50 mg·L-1的轉(zhuǎn)化效率最高[35]。合適的AS濃度可以提高棉花轉(zhuǎn)化效率，但AS濃度高于500 μM時會降低轉(zhuǎn)化效率。綜上所述，共培養(yǎng)期間添加50 mg·L-1的AS時，轉(zhuǎn)化效率較高。

2.3 農(nóng)桿菌感染濃度、感染時間

農(nóng)桿菌感染濃度對轉(zhuǎn)化效率有很大的影響。Jin等報道侵染棉花愈傷組織時，菌液感染濃度OD600為0.5時的轉(zhuǎn)化效率比OD600為1.0或1.5時的轉(zhuǎn)化效率更高。大多數(shù)研究者在侵染愈傷組織時采用的農(nóng)桿菌感染濃度OD600值為0.3～0.5，Wu采用OD600為0.2～0.3的菌液進行侵染。劉傳亮等構(gòu)建棉花規(guī)?；D(zhuǎn)基因技術(shù)體系時，發(fā)現(xiàn)在原有轉(zhuǎn)化體系中，選擇的侵染濃度OD600值為0.3～0.7時，許多切段容易死亡，而適當(dāng)降低菌液感染濃度OD600值至0.1～0.3可提高愈傷組織發(fā)生率，侵染15～20 min為宜。劉衛(wèi)民等試驗表明侵染棉花下胚軸所用的農(nóng)桿菌濃度OD600為0.4～05，侵染時間在10～15 min時，轉(zhuǎn)化效率最高，返菌率也很低;而侵染時間為20～30 min時，轉(zhuǎn)化率急劇下降，返菌率也顯著升高。綜上所述，農(nóng)桿菌感染濃度OD600值為0.3左右時，轉(zhuǎn)化效率較高。另外，在壓力為186.158 kPa時，用農(nóng)桿菌菌液真空滲入10 min可以顯著提高轉(zhuǎn)化效率，比常規(guī)轉(zhuǎn)化效率高出一倍多[36]。

2.4 共培養(yǎng)溫度和時間

Sunilkumar、Rathore和Jin等用可視化蛋白GFP作為標(biāo)記，隨著時間觀察轉(zhuǎn)基因的定位，該技術(shù)可以幫助優(yōu)化影響轉(zhuǎn)化效率的各種因素，尤其是共培養(yǎng)時間和溫度。此外，采用可視的篩選標(biāo)記可以在早期輕易找到轉(zhuǎn)基因表達細胞系。試驗發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌侵染42～45 h后可觀察到GFP的表達，共培養(yǎng)3 d后GFP穩(wěn)定且大量表達，4 d時所有細胞內(nèi)均可檢測到GFP表達。但外源基因在轉(zhuǎn)基因材料中的瞬時表達和穩(wěn)定表達是相關(guān)聯(lián)但又不同的，因為高水平的瞬時表達并不一定會導(dǎo)致高水平的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。多數(shù)棉花轉(zhuǎn)化體系會采用48 h的共培養(yǎng)時間。Wu等通過GUS染色發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)48 h、72 h時，轉(zhuǎn)化效率并無差異。培養(yǎng)時間過長，愈傷組織會出現(xiàn)褐化和壞死現(xiàn)象，出愈率較低[37-38]。

共培養(yǎng)溫度也是影響轉(zhuǎn)化的重要因素。研究者對共培養(yǎng)溫度為21 ℃、25 ℃時，農(nóng)桿菌LBA4404的轉(zhuǎn)化效率進行了研究，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)溫度為21 ℃時，轉(zhuǎn)化效率更高。Wu等在研究農(nóng)桿菌侵染陸地棉愈傷組織時，設(shè)置了19 ℃、23 ℃、26 ℃等3個共培養(yǎng)溫度梯度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)溫度在19 ℃時，轉(zhuǎn)化效率達到最高[32]。

2.5 抗生素

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法中，有兩類常用的抗生素，一類具有篩選作用，如卡那霉素和潮霉素;另外一類用來殺死農(nóng)桿菌，如氨芐青霉素和頭孢霉素（500 mg·L-1）。在遺傳轉(zhuǎn)化中，很多基因以NPT II（抗卡那霉素）作為選擇標(biāo)記基因，卡那霉素的使用濃度是影響轉(zhuǎn)化效率的一個重要因素。有研究表明，將卡那霉素濃度設(shè)為25 mg·L-1，愈傷組織呈淡黃色，生長迅速，成活率為98%～100%;濃度上升為50 mg·L-1時，愈傷局部生長速度變緩，成活率在80%以上;而當(dāng)濃度提升至100～150 mg·L-1時，愈傷生長緩慢甚至停滯，成活率也下降至14%～40%。很明顯，高濃度抗生素對植物產(chǎn)生毒害作用，低濃度抗生素會導(dǎo)致非轉(zhuǎn)化細胞生長旺盛，再生受到抑制，無法對抗性愈傷起到篩選作用。棉花子葉和下胚軸作為外植體誘導(dǎo)胚性愈傷組織發(fā)生時，10 mg·L-1或更高濃度的卡那霉素使愈傷組織形成數(shù)量減少;濃度達到60 mg·L-1時，愈傷組織的生長、增殖和體細胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)過程完全受到抑制。成熟的體細胞胚對卡那霉素不敏感，此階段很難篩選到轉(zhuǎn)化子[39]。

在轉(zhuǎn)基因的愈傷組織誘導(dǎo)和增殖階段，卡那霉素的最佳使用濃度為40～60 mg·L-1;而在篩選轉(zhuǎn)基因的胚性愈傷組織和體細胞胚時，卡那霉素的濃度應(yīng)增加至200 mg·L-1。100 mg·L-1的卡那霉素篩選3次，7～8周，也能獲得很好的篩選效果。

另外，在培養(yǎng)基中原始愈傷組織的大小也會影響愈傷組織的出愈率，規(guī)格較大的愈傷組織更易存活下來。及時傳代培養(yǎng)及培養(yǎng)皿中愈傷組織的數(shù)量也會影響體細胞胚胎的發(fā)芽率，這是棉花組培中的一個重要步驟。因此，研究人員必須注意這些方面以提高整體轉(zhuǎn)化效率。

3 結(jié)語

近些年來，隨著轉(zhuǎn)化技術(shù)體系的不斷創(chuàng)新和完善，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化得以在全國范圍內(nèi)推廣開來，呈規(guī)模化生產(chǎn)。例如，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所李付廣研究員主持的“棉花規(guī)模化轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系平臺的建設(shè)及其應(yīng)用”有效組裝多種轉(zhuǎn)基因技術(shù)，實現(xiàn)了規(guī)?；?、高效率的棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作，年均獲得轉(zhuǎn)基因棉花植株6 000株以上，不僅降低了轉(zhuǎn)基因成本，還拓寬了受體的基因型范圍和外植體范圍?，F(xiàn)階段除了棉花下胚軸之外，葉柄、真葉和根等都可以通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得完整的轉(zhuǎn)基因植株，但有待進一步探究農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化過程受眾多內(nèi)在和外在因素的綜合影響的分子機制，以便將遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用于更多的商用棉花品種，減免雜交回交，縮短育種年限。

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（責(zé)任編輯：易? 婧）