CRISPR/Cas9基因編輯技術:基因剪刀—重寫生命密碼的工具
——2020年諾貝爾化學獎簡介

谷思宇 楊曉梅 賀俊崎

(首都醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學學系，北京 100069)

1 獲獎者簡介

1.1 埃瑪紐埃爾·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)

Emmanuelle Charpentier (圖1)，1968年12月11日出生于法國奧爾日河畔瑞維西。本科就讀于巴黎第六大學(UPMC)，后進入巴斯德研究所攻讀博士學位(1986-1995)。1996-1997年，分別于巴黎巴斯德研究所和紐約洛克菲勒大學進行博士后研究。2002年，在維也納建立自己的實驗室。2009年6月赴瑞典于默奧微生物研究中心繼續研究，8月她的小組通過實驗探明了CRISPR系統的機制。2011年之后與杜德納合作發展CRISPR技術。現就職于德國柏林馬克斯·普朗克病原學研究室。

1.2 詹妮弗·杜德納(Jennifer A.Doudna)

Jennifer A.Doudna(圖2)，1964年出生于美國華盛頓特區。1895年,Doudna獲得波莫納學院學士學位，1989年，獲得哈佛大學博士學位，畢業后于麻省總醫院和哈佛醫學院進行分子生物學博士后研究。現為美國加州大學伯克利分校教授，霍華德·休斯醫學研究所研究員。

圖2 Jennifer A.Doudna

2 主要科學貢獻：建立CRISPR/Cas9系統

自DNA雙螺旋結構發現以來，用于制造和操縱DNA的技術已在生物學上取得了進步。1972年，P.Berg構建了第一個DNA重組分子，標志著生物基因工程的核心的開始。但在細胞和生物體的基因組中引入位點特異性修飾仍然難以實現。在CRISPR/Cas9技術用于基因組編輯之前，科學家們開發了使用DNA-蛋白質識別原理的鋅指核酸酶(ZFNs)和TAL效應因子核酸酶(TALENs)進行基因編輯。然而ZFN基因編輯有很強的局限性，不能識別任意目標基因序列，并且識別序列經常受上下游序列影響。TALEN 技術利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結合任意DNA序列的模塊化蛋白，從而達到靶向操作內源性基因的目的，克服了ZFN方法的不足，但在構建過程中，TALE 分子的模塊組裝和篩選過程比較繁雜，需要大量的測序工作。對于普通實驗室的可操作性較低。因此，迫切需要一種高效、易操作的基因編輯技術，CRISPR/Cas9系統應運而生。

1987年，Nakata博士領導的課題組在K12大腸桿菌中研究其目的基因iap時偶然間發現了一段串聯間隔重復序列，且這些重復序列被含32個堿基的序列間隔開，而當時并不清楚這種序列的生物學意義[1]。2002年，Jansen博士領導的實驗室通過生物信息學分析，發現了一種新型的重復DNA序列家族，且該家族只存在于原核生物中，在真核生物及病毒中卻不存在，這種序列被稱為規律間隔成簇短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)，并在含CRISPR的原核生物中發現了4個與CRISPR相關的(cas)基因(cas1,cas2,cas3,cas4)，且cas基因始終位于CRISPR基因座附近[2]。2005年，Mojica博士等多位科學家發現CRISPR中的間隔序列來自于外來噬菌體或質粒，病毒無法感染攜帶有與病毒同源間隔序列的細胞，而易侵入那些沒有間隔序列的細胞，由此他們提出CRISPR可能參與細菌的免疫功能的假說。2007年，這一假說被Danisco 公司的兩位科學家——Rodolphe Barrango和Philippe Horvath所證實。他們發現嗜熱鏈球菌中存在 CRISPR 序列，能夠幫助細菌識別、抵抗噬菌體DNA的侵入[3]。

2011年，本次諾獎得主之一 的Emmanuelle Charpentier博士發現了CRISPR基因編輯系統的最后一塊拼圖-tracrRNA，由此CRISPR系統最終可以實現定向剪切目標基因[4]。隨后Emmanuelle Charpentier博士與另一位諾獎得主Jennifer A.Doudna博士合作研究CRISPR基因編輯系統在試管中精確切割DNA，2012年，兩人將CRISPR-Cas9的研究成果公之于眾。同時，這兩位科學家所帶領的研究團隊純化出了Cas9蛋白，發現了Cas9 的切割作用和crRNA 的定位作用，并首次利用這個系統對特定DNA分子在體外進行靶向切割化學反應，顯示出CRISPR在活細胞中修改基因的能力。她們是最早從事把細菌天然免疫系統演變成CRISPR/Cas9基因編輯工具研究的科學家，她們為該技術后續的應用勾勒出基本的框架和路線。

隨后，麻省理工學院的華人科學家張鋒和來自哈佛大學醫學院的George Church改進了技術，成功地將 CRISPR-Cas9系統運用到真核生物(哺乳動物)細胞中[5]，使人們開始認識到這一技術的變革性力量，由此極大地推動了CRISPR/Cas9技術在生命科學研究領域內的推廣和應用。張鋒和他所在的Broad研究所在美國擁有CRISPR/Cas9技術應用于所有真核生物——包括植物、動物和人類的專利，這是CRISPR技術商業化最為核心的專利之一。

麻省理工學院教授Phillip Sharp(1993年諾獎得主)曾表示：Charpentier、Church、Doudna和張鋒是建立CRISPR基因編輯技術最重要的貢獻者。然而基于諾獎傳統最多頒給三人的傳統習俗，他們無法共享諾獎。因而他認為一個比較合理的組合是：諾貝爾化學獎頒給Doudna和Charpentier，以彰顯她們在CRISPR/Cas9技術建立過程中生物化學方面的研究成就；生理或醫學獎頒給Church和張鋒，以彰顯他們在活體細胞中成功建立了CRISPR/Cas9技術體系，為該技術的醫學應用鋪平了道路。因此2020年諾貝爾化學獎頒發給Emmanuelle Charpentier博士和Jennifer A.Doudna博士，作為該技術的初創者，她們獲獎是實至名歸。對于此次錯失諾貝爾獎，Church博士坦然接受并認為諾貝爾委員會做出了“一個非常明智的選擇”。他認為他們中的任何一個人都不會因為沒有獲得諾貝爾獎而受到輕視。在他看來Charpentier和Doudna做出了一項重大發現，這是委員會授予她們諾貝爾獎的原因，而他和張鋒更像是技術發明家。他甚至還打趣說：“如果有人想獲得如何不獲得諾貝爾獎的任何技巧，那很容易。” “通過專注于發明，我已經謹慎地避免了所有此類煩惱。” 他還說，張鋒仍很年輕，“張鋒充滿了創意，我毫不懷疑他將來會獲得一兩個。”

3 CRISPR/Cas9系統原理

CRISPR是細菌中成簇存在的被規律間隔的短回文重復序列，是一種古老的抵御病毒入侵的方式。在噬菌體感染細菌時，噬菌體的一段 DNA序列，會整合入細菌的CRISPR重復序列中，當該噬菌體再次入侵時，那么這個免疫系統會被激活，來干擾噬菌體DNA。CRISPR 序列會轉錄出一段與先前整合的那段噬菌體DNA序列互補的 RNA，即 CRISPR RNA (crRNA)，然后 crRNA、Cas蛋白核酸酶組成CRISPR/Cas系統，特異性識別并切割噬菌體DNA[6](圖3)。

圖3 CRISPR干擾的免疫過程[6]

根據參與作用的Cas蛋白基因的序列和結構特點，CRISPR-Cas系統可分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型三種類型[7]，其中Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR-Cas系統的標記基因分別為Cas3(屬于解旋酶家族成員) 和Cas10(具有和核酸聚合酶以及核酸環化酶同源的結構域)，除此之外還需要多種相關 Cas 蛋白，基因編輯系統較為復雜[8](圖4)。而Ⅱ型CRISPR-Cas是三種類型中最簡單的系統，僅需要一種Cas9蛋白[9]。

目前使用的CRISPR/Cas9系統中，crRNA和tracrRNA被組合在一起改造成向導RNA(single-guide RNA，sgRNA)，指導Cas9蛋白定點切割DNA序列。該系統需要在靶標DNA上有一段保守的前間隔區序列鄰近基序(protospacer adjacent motif，PAM)作為搜索目標。對于Ⅱ型CRISPR系統一般為5-NGG-3′序列，一旦找到PAM，Cas9就使DNA局部解鏈，sgRNA與DNA互補，Cas9對靶序列進行定點剪切。

4 CRISPR/Cas9系統應用前景、挑戰與爭議

4.1 應用前景

在過去的幾年內，研究人員已成功地將CRISPR/Cas9基因編輯技術應用到多種生物中,極大地促進了生物基因組功能的研究。

4.1.1 植物和動物

通過基因編輯技術實現對植物多基因調控性狀的改良，如耐寒、抗旱和高產優質新品系的篩選培育。如WRINKLED(WRI)在大豆油脂合成積累中具有關鍵作用，閆麗[10]利用CRISPR/Cas9技術通過抑制轉基因受體植株中內源基因GmWRI11a的表達，創制大豆GmWRI1a基因突變體，發現轉基因突變體植株中糖酵解和脂肪合成相關基因的表達量下降，解析了該基因在調控大豆種子油脂合成中的作用。在動物研究方面，CRISPR 基因編輯技術已被成功應用于小鼠、大鼠、斑馬魚、果蠅和猴子等的基因組編輯。

4.1.2 醫學

基因編輯技術已經用于藥物研發、疾病治療和異體器官移植等。如四川大學華西醫院胸部腫瘤科盧鈾教授團隊進行了首次CRISPR-Cas9基因編輯的人體臨床試驗，并于2016年10月進行了首例受試者治療，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術在體外T細胞中編輯PD-1基因，經體外T細胞培養擴增，再輸回非小細胞肺癌(NSCLC)受試者，首次證明了該療法在NSCLC中的安全性和可行性[11]。

4.2 挑戰與爭議

4.2.1 脫靶效應及倫理問題

2018年11月26日，前南方科技大學副教授賀建奎宣布一對名為露露和娜娜的基因編輯嬰兒于11月在中國健康誕生，由于這對雙胞胎的一個基因(CCR5)經過修改，她們出生后即能天然抵抗艾滋病病毒(HIV)。這一消息瞬間震動了世界。“基因編輯嬰兒”事件之所以引起社會強烈關注，一方面是因為該技術的不確定性，脫靶效應這一有爭議的問題一直影響著CRISPR/Cas9系統的應用，會給受試者和嬰兒均帶來巨大的健康隱患，另一方面則更多的是因為存在倫理問題，這種行為肆意踐踏基因編輯技術臨床應用的倫理底線，違背有關人類受試者試驗研究的基本規范，編輯人類生殖細胞基因可能會帶來無法預知的災難性后果，出于安全風險、社會及醫學倫理等方面的考慮，基因編輯技術的應用仍有待嚴格規范。

4.2.2 專利之爭

持續多年的CRISPR專利爭奪主要在Broad研究所的張鋒團隊與加州大學伯克利分校的Doudna團隊之間展開。雖然加州大學伯克利分校率先在歐洲專利局提交了關于將CRISPR技術用于cell-free系統中專利的申請，但是張鋒和Broad研究所搶先一步在美國獲得了真核細胞CRISPR/Cas9基因編輯技術的專利授權，而這正是該技術最有應用前景的領域。加利福尼亞大學一方于2017年4月對這項裁決提起上訴，稱他們的原始應用覆蓋了所有細胞、植物、動物和人類，而不是只局限于細菌的基因編輯。2018年9月份，美國聯邦巡回上訴法院裁定，維持美國專利審判與上訴委員會的判決。張鋒和Broad研究所將繼續擁有在真核生物中使用CRISPR基因編輯的知識產權。Doudna博士雖然沒有贏得真核細胞CRISPR/Cas9基因編輯技術的專利授權，但是此次榮獲諾貝爾獎，也是失之東隅,收之桑榆。

5 小結

2012年，Jennifer A.Doudna和Emmanuelle Charpentier兩位教授向 《科學》投文“the Cas9 endonuclease can be programmed with guide RNA engineered as a single transcript to cleave any double-stranded DNA sequence”，僅用了20天編輯部就接受了該文。這篇文章標志著對CRISPR/cas9系統的最后技術突破，為CRISPR作為基因編輯工具的應用奠定了堅實的基礎。2020年10月7日，僅8年時間，兩位教授就摘取了諾貝爾獎桂冠。這主要歸功于基因編輯CRISPR-Cas9技術的重要性和影響力。如今，CRISPR/Cas9技術已滲透到生命科學學科的各個領域。也為整個科研界一場深刻的革命奠定了基礎。