新藤黃酸體外抗肺癌血管生成的作用機制研究

朱亞芳

（河北中石油中心醫院，河北 廊坊）

0 引言

據資料顯示，癌癥已經成為了威脅人類生命健康的主要疾病之一，其具有發病隱蔽、轉移性高、復發率高、腫瘤細胞耐藥強等特點，導致臨床治療困難[1-3]。為了有效的控制疾病的發展，提高患者的生活質量與生存率，急需一種有效的抗腫瘤藥物。據資料顯示，新藤黃酸對不同腫瘤細胞的增殖具有有效的抑制作用，能明顯控制患者病情的發展，提高其生活質量和生存率[4-8]。本研究就是為了分析觀察新藤黃酸對肺癌血管生成的影響以及初步的作用機制，具體結果如下。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料：選用中國科學院上海細胞庫的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）和人肺腺癌細胞A549，以及上海源葉生物有限公司的新藤黃酸。

檢測材料：胎牛血清，DMEM高糖培養基，Matrigel，胰蛋白酶，DAPI，An-NexinV-FITC/PI雙 染 法 試 劑 盒，LY294002，Akt、β-actin抗體，PI3K、p-PI3K、p-Akt、VEGF，PI3K、Akt、β-actin引物，PTENsiRNA序列（上游 5’-GGCUAAGUGAAGAUGACAATT-3’和 下 游 5’-UUGU-CAUCUUCACUUAGCCTT-3’），Lipofectamine 2000TM。

儀器材料：生物安全柜、高壓滅菌鍋、高速立式冷凍離心機、倒置熒光顯微鏡、流式細胞儀。

1.2 方法

1.2.1 新藤黃酸對HUVEC血管成管的影響

選用24孔細胞培養板，在使用前先放置4℃溫度下預冷，接著將液體狀態的Matrigel膠注入各孔，按照300μL/孔的規格，然后將培養板放入37℃培養箱中培養30min。最后將HU-VEC接種于用Matrigel膠覆蓋的細胞培養板，按照8×104個/孔的規格，并依次加入不同濃度的培養基進行培養（37℃，5%CO2）。通過倒置顯微鏡于培養18h后對其的管狀結構的形態進行觀察記錄[9-10]。

1.2.2 新藤黃酸對細胞凋亡率的影響

①將對數生長期的HUVEC接種于6孔板中，按照1×105個/孔的規格。先對其進行孵育培養，然后將舊培養液換成含1，2，4μmol·L-1GNA的條件培養液繼續培養24h。接著采用不含EDTA-Na2的細胞消化液進行消化離心處理，并收集處理后的細胞。②對收集到的細胞使用4℃預冷的PBS緩沖液進行沖洗（2遍，1800r·min-1離心5min）。然后加入400μL的PBS重懸細胞、5μL的AnnexinV-FITC，并使用吹打管吹打均勻，避光培養15min后，再加入5μL的PI進行充分混合，避光培養5min后使用流式細胞儀檢測。

1.2.3 新藤黃酸對蛋白表達的影響[11]

①將各組細胞消化收集后的細胞，使用PBS（4℃）進行洗滌2次，然后加入PMSF的RIPA細胞裂解液并置于冰上孵育10min，接著采用高速立式冷凍離心機進行離心分離（12000r·min-1）5min后收集上層澄清液于EP管中，最后加入LoadingBuffer后于100℃下煮10min，置于4℃下保存。②采用蛋白定量試劑盒和ECL試劑盒嚴格根據說明書對其進行操作。

1.2.4 PTEN-siRNA轉染細胞后，新藤黃酸對PI3K，Akt基因的表達水平的影響

①在6孔板中接種細胞，按照1×106/孔的規格，然后加入不含抗生素的培養基1.8mL。從每孔中取出2μL的50μmol/LPTEN-siRNA儲液，并將其溶于Opti-MEMIReducedSerumMedium中進行稀釋混合。②根據Lipofectamine2000TM5μL/孔、Op-ti-MEMI ReducedSerumMedium100μL/孔的規格進行稀釋混合，并放置于常溫下保存5min。③將兩組進行混合，并放置于常溫下保存20min，然后除去舊培養基并使用不含血清培養基洗滌2次，并給每孔換上新鮮培養基1.8mL后，加入轉染試劑，并于輕輕搖勻后繼續培養6h。④采用流式細胞儀和biocaptMV軟件，嚴格參照說明書對轉染效率和mRNA的相對表達量進行檢測。

1.3 統計學分析

使用SPSS 20.0軟件做統計學結果分析。

2 結果

2.1 新藤黃酸對HUVEC血管成管的影響

倒置顯微鏡下發現，新藤黃酸能使得HUVEC細胞形態變成梭狀，并向凝膠基質中延伸，呈現線性排列并形成管腔樣結構。并且由于濃度的不同，細胞成管數不同，隨著濃度的增加，細胞管腔樣結構逐漸減少。

2.2 新藤黃酸對細胞凋亡率的影響

流式細胞儀結果顯示，細胞凋亡率在GNA的1、2和4μmol/L濃度下分別為（4.5±1.9）%，（9.2±2.4）%，（30.5±6.4）%，與空白對照組（0.21±0.02）%相比具有明顯差異（P＜0.05）。

2.3 新藤黃酸對蛋白表達的影響

HUVEC的p-PI3K，p-Akt蛋白表達量隨著GNA藥物濃度的增加而下降，但蛋白PI3K表達量基本不變。當PTEN-siRNA轉染細胞后，結果顯示經GNA作用后PI3K，AktmRNA基因的表達水平明顯高于空白對照組（P＜0.05）。

3 討論

藤黃（gamboge）為藤黃科植物藤黃Garcinia hanbaryi Hook.f.的樹干被割傷后流出的膠狀樹脂[12-14]。近20年來，對藤黃及其活性成分藤黃酸等做了大量的研究工作，發現藤黃具有抗癌作用，并經多次實驗重復證明其主要的有效成分是以藤黃酸（gambogic acid）為代表的橋環化合物，其抗癌作用與一般的化療抗癌藥有所區別，能選擇性地殺死癌細胞，而對正常的造血系統和白細胞沒有影響[15]。1984年呂歸寶從中藥藤黃中分離得到新藤黃酸，根據目前研究表明，新藤黃酸與藤黃酸相比具有作用強，毒性低、穩定性好和抗癌譜廣等特點。

VEGF是目前所知最強的、直接作用于血管內皮細胞的血管生成促進因子。普遍認為VEGF是腫瘤血管生成的一個關鍵調節者。VEGF是內皮細胞上特異性的有絲分裂素，與其受體Flt-1和KDR/Flk-1選擇性位于血管內皮細胞上，激活VEGF和其受體皆可促進內皮細胞的有絲分裂，刺激血管生成的全過程，增強微血管通透性。

實驗結果顯示，中藥藤黃中含有新藤黃酸對肺腺癌A549細胞具有較強的增殖抑制作用，能有效的誘導A549細胞發生凋亡及抑制細胞自噬，并且還具有抑制血管生成的作用（抑制效果與劑量有關）和抑制p-PI3K，p-Akt蛋白的表達水平的作用。當PTEN-siRNA轉染入細胞后，能促進PI3K，AktmRNA基因的表達與空白對照組相比（P＜0.05）。

綜上所述，新藤黃酸具有抑制內皮細胞的小管形成和誘導內皮細胞凋亡的作用，能有效的阻斷腫瘤血管生成中的重要環節。其具有的抑制內皮細胞小管形成和誘導細胞凋亡的機制可能與PI3K/Akt信號通路有關。