孤立性肺結節無創診斷的相關研究進展

王春秀，徐麗新，王爽，李彩紅，石浩田，黃艷

(華北理工大學附屬醫院呼吸內科,河北 唐山)

0 引言

孤立性肺結節（solitary pulmonary nodule, SPN）定義為直徑最大為3cm 且被充氣肺完全包圍的單一的界限清楚的放射學不透明性的病灶，臨床表現常見胸水、病灶部肺不張以及肺門異常增大等[1]。孤立性肺結節性質被分為兩種，一是癌性，即惡性；二是非癌性，即良性。其中約90% 以上的直徑小于2cm 的SPN為非癌性的[2]。常見的惡性病變為鱗癌、肺腺癌、單發惡性腫瘤轉移灶等。在全球范圍內，肺癌是癌癥發病率和死亡率最高的疾病，2018 年全世界有210 萬新增和180 萬死亡肺癌病例，約占惡性腫瘤死亡人數的1/5( 18. 4%)[3]。在我國，肺癌的發病率與死亡率也居于首位，于2017 年我國國家癌癥中心公布最新的數據顯示，無論大中小城市，肺癌發病率與死亡率處于全國排名第一[4]。惡性SPN 是肺癌早期表現，隨著人們健康意識的提高、科技的發展，低劑量螺旋CT 應用于檢查的普遍性，很大程度上提高了0.2% 至50% 左右的SPN 檢出率[5]。研究證實進行肺部結節早期良惡性的篩查及制定相應的治療方案，可降低大概20% 的肺癌死亡率[6]。因此，對惡性SPN 精準的評價十分重要。

1 胸部CT

胸部CT 是SPN 良惡性鑒別診斷有價值的無創性檢查之一[7]。是重新評估胸部X 線檢查可見的肺結節并持續監測結節大小變化的影像學檢查手段，惡性SPN 的CT 影像特征通常包括：不規則或尖刻的邊界可伴有分葉及毛刺、一般為非鈣化或偏心鈣化（在類癌、骨惡性腫瘤肺轉移等約2%-13%的惡性SPN 中有鈣化情況）、密度呈磨砂樣（不均勻）、直徑最大1cm 以上、位于肺上葉、胸膜凹陷和血管集束征等[8]。SPN 大小是鑒別良惡性的關鍵，可為獨立危險因素[9]。惡性SPN沒有明確特異性的影像特征，因而需通過SPN 大小，邊界，密度，鈣化和生長等特征預測惡性腫瘤。

2 增強 CT

快速的靜脈注射 ( 濃度：300mg/m L；速度：2mL/sec) 碘化造影劑，結節強化后小于15HU 高度提示良性可能性大；強化超過20HU，則反映結節含新生血管，提示惡性可能。增強CT 局限于易將炎性病變誤診為惡性，也易發生小結節測量誤差等。有研究[10]指出惡性SPN 可被動態增強CT 檢出的敏感性大于95%。

3 MRI

MRI 對異常組織的分辨力高，對軟組織以及血管顯影的清晰度高，對其內部血液流動敏感[11]。MRI 增強對惡性SPN 的診斷有一定的幫助，但因心跳呼吸等運動偽影等影響，臨床上很少應用MRI 診斷肺部結節性質。

4 PET-CT

PET-CT 可檢測肺部結節的代謝狀態。由于腫瘤細胞代謝活躍，攝取顯像劑能力較正常細胞顯著，因此在惡性病變細胞早期尚未產生解剖結構變化前，即能發現隱匿的微小病灶(大于5mm)。PET-CT 的敏感性、特異性和準確性較CT 更高[12]。其敏感性及特異性根據SPN 結節性質的不同而改變。研究報道指出雖然PET-CT 在病灶有炎癥反應時可能出現假陽性的結果，對早期腺細胞癌診斷亦可能出現假陰性結果，但其對于直徑大于8mm 的實質惡性SPN 的診斷價值很高[13]。

5 痰液細胞學檢測

根據痰液病理中脫落癌細胞對SPN 性質作出診斷。因陽性率低，假陰性率高是痰涂片檢查的弊端，臨床上很少能通過痰細胞學檢查對早期惡性SPN 進行診斷。隨著科技不斷發展，DNA 痰液檢測技術提高了惡性SPN 的診斷的陽性率。

6 傳統腫瘤標志物

腫瘤標志物在SPN 中較正常組織可出現異常高值[14]。目前常見腫瘤標志物包括癌胚抗原( carcinoembryonic antigen，CEA)、胃泌素釋放肽前體( progastrin releasing peptide，Pro-GRP)、神 經 特 異 性 烯醇 化 酶 ( neurone specific enolase，NSE)、細 胞 角 蛋白19 片段抗原21- 1( cytokeratin 19 fragment 21-1，CYFRA21- 1)、糖 類 抗 原 ( carbohydrate antigen，CA) 125、鱗狀細胞癌抗原( squamous cell carcinoma antigen，SCC- Ag)、鐵蛋白等。有研究指出，CEA 有必要與其他腫瘤標志物聯合檢測提高診斷的敏感性，原因是其單獨檢測對肺結節性質診斷的特異性較高，敏感性較低[15]；NSE 常用于小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）的診斷及相關治療效果監測[16]；Pro-GRP 是SCLC 首選的腫瘤標志物，對SCLC 診斷的敏感性和特異性較NSE 更高[17]，因此Pro-GRP 和NSE可以聯合應用于SCLC 的早期診斷；血清CYFRA21-1在肺鱗癌中與其他類型肺癌相比水平明顯升高[18]，Qu 等[19]的一項回顧性研究發現，惡性與非惡性SPN中血清CYFRA21-1 存在顯著差異，因此可用于肺結節性質的診斷[20]；惡性肺結節患者血清SCC- Ag 水平較良性肺結節患者明顯升0 高，若聯合監測血清SCC- Ag、CEA、 NSE 和 CYFAR21- 1 等 水 平，診 斷的敏感性和特異性更高[21]，目前尚無研究證據顯示單獨應用血清SCC- Ag 水平升高用于肺結節診斷的特異性；賈國華等[22]研究指出，CA125 單獨用于診斷肺癌的靈敏度（17.11%），特異度（97.56%）；CA125、CEA、NSE 和 CYFRA21- 1 聯合檢測惡性肺結節的靈敏度為72.37%、特異度 73.17% 、準確度為72.65%；Sukiennicki[23]等針對肺癌患者和正常人群的血清鐵蛋白水平的對照研究顯示，肺癌患者血清鐵蛋白水平顯著高于正常人群; 且血清鐵蛋白水平與肺癌的發生密切相關，在惡性病變患者血清鐵蛋白水平較正常人群及良性病變患者均有升高，可作為臨床評估惡性肺結節性質的潛在標志物[24]。因腫瘤標志物表達受多種因素影響，故多種腫瘤標志物聯合檢測的方法對惡性SPN 的診斷仍存在很大的不穩定性，仍然需要繼續尋找更為高效、穩定判斷出惡性SPN 的無創方法。

7 免疫學標志物

腫瘤特定抗原或腫瘤相關抗原( tumorassociatedantigens，TAAs)。TAAs 自身抗體可在惡性肺結節早期階段檢測出，TAAs 自身抗體較TAAs 在血清中可穩定、高水平的長時間存在，因此TAAs 自身抗體可以用來診斷評估惡性肺結節[25]。特定的TAAs 自身抗體常常出現在無癥狀病變早期，可在CT 檢查結果無法評估診斷之前出現異常值。國外當前應用于臨床的TAAS 自身抗體譜包括p53、性別決定基因家族2、蛋白基因產物9.5、黑色素瘤抗原A1、CAGE、GBU4-5G、抗原 - 7 抗體等 7 種，Jett 等[26]研究顯發現，基于以上自身抗體診斷肺癌的特異度可達91%，靈敏度可達37%，陽性預測值可達16%。Massion 等[27]研究顯示，以上7 種腫瘤自身抗體譜對直徑在4～20mm 肺結節性質檢測的準確性有顯著的升高。Sullivan 等[28]研究指出，TAAs 自身抗體對肺癌和早期惡性肺結節的診斷具有較高價值。一項對中國人群的臨床研究表明，應用以上7 種TAAs 自身抗體對肺結節性質診斷的靈敏度和特異度分別為61%和90%[29]。多個研究表明，以上免疫標志物可與CT 聯合應用提高對肺結節性質評估的準確性，但以上TAAs 自身抗體無特異性，在其他腫瘤以及其相關免疫性疾病中亦可升高，仍存在一定的局限性，此外，由于肺癌質性的差異，單一的TAAs 自身抗體對于檢測肺癌類型還存在不足。

8 RNA 相關標志物

微RNA( microRNA，miRNA) 是真核生物調控非編碼基因的RNA，miRNA 通過調控原癌和抑癌基因的表達作用，導致惡性腫瘤相關miRNA 水平改變。有研究發現，惡性較良性肺結節患者血清中miR-21-5p 和miR-574-5p 呈高水平表達[20]，Shen 等[30]研究指出，孤立性肺結節組miR-21 和miR-210 水平明顯升高，而惡性肺結節組較健康組及良性肺結節組miR-486-5p 呈低水平表達，因此，肺結節惡變相關的血miRNA水平對早期惡性肺結節的診斷有一定的指導價值。

9 DNA 甲基化

DNA 甲基化是基因轉錄和基因組穩定性的關鍵調節劑。DNA 甲基化水平的改變經常在人類腫瘤中發現，包括肺癌[31-32]。早于2005 年，德國海涅大學的Schmiemann V 等提出了檢測基因甲基化異常狀態診斷早期惡性肺部病變[33]。明顯的肺癌惡性表型較DNA 甲基化相對滯后[34]，基因甲基化一般發生在癌前病變和癌變早期，因此DNA 甲基化可以作為腫瘤早期及惡性SPN 診斷的理想標志物。在腫瘤的發生發展過程中，腫瘤細胞釋放DNA 進入血液，在體液中可以檢測出某些基因的甲基化，因此DNA 甲基化可應用外周血取樣[35]。有研究指出，病變組織及外周血樣本中的某種DNA 甲基化檢測結果水平大致相同[36]。因此非常適合無創檢測惡性病變的早期診斷。多種DNA甲基化可以用作肺癌早期診斷的有前途的生物標記，例 如 p16，RASSF1A，APC，DAPK，RARβ ，CDH13，RUNX3，SHOX2 和 PTGER4 等。

p16 基因，是細胞周期蛋白依賴性激酶4 的抑制劑，細胞中p16 純合子基因異常狀態致使細胞增殖異常，引起惡性病變。研究表明，吸煙者中該基因甲基化存在增高趨勢，與良性肺部病變患者相比惡性患者中p16 基因甲基化呈高水平表達，肺腺癌相比肺鱗癌患者中p16 啟動子甲基化率明顯增高。在這個研究中顯示p16 基因甲基化參與了肺癌的發病機制，并且是惡性SPN 病變的危險因素[37]。

RASSF1A 是Ras 家族的基因之一，與人類腫瘤中Ras 信號轉導途徑的激活有關，是重要的抑癌基因，調控細胞周期，抑制腫瘤的發生和發展[38]。RASSF1A 基因啟動子區域的高度甲基化可以下調該基因，使RASSF1A 失去抑癌功能，從而可誘發惡性病變。RASSF1A 在癌癥早期進展中就開始發揮作用。RASSF1A 的異常甲基化已在肺癌中報道[39-40]。

抑癌基因APC，該基因啟動子區過度甲基化導致抑癌基因表達的異常，以至于細胞惡性增殖及分化，甚至細胞無法正常凋亡，導致細胞癌變。Feng 等[41]研究顯示，APC 基因在肺癌中的甲基化率為22.0%，Huang等[42]對151 項研究進行的薈萃分析示惡性肺部結節患者血清中該抑癌基因甲基化率較良性肺部疾病患者顯著增高。

死亡相關蛋白激酶（death associated protein, DAPK）[43]是一類多基序鈣調控的絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶。DAPK 可以正調控細胞凋亡，參與細胞自噬等生理過程。DAPK 的功能障礙及失活可使細胞異常增殖，導致細胞惡性病變。DAPK 基因的啟動子基因的甲基化水平程度根據惡性腫瘤細胞的而不同而改變。

維甲酸受體β（Retinoic acid receptor-beta，RARβ）基因位于3p24 號染色體，這是肺癌中經常缺失的區域，誘導其表達可以抑制癌變。曾有研究報道，在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）組織中經常觀察到RARβ 甲基化程度高，Song X[44]等報道，與非惡性肺組織相比，NSCLC 中RARβ 啟動子的高度甲基化顯著增加，并且在非典型類癌（atypical carcinoid，AC）中占主導地位，這表明RARβ 甲基化有助于NSCLC（特別是AC）的發展。

T- 鈣黏蛋白( T-Cadherin/H-Cadherin, CDH13)是一種新型鈣黏蛋白分子。有研究指出，很多不同惡性腫瘤細胞中CDH13 CPG 島的甲基化以及CDH13 基因表達沉默，而正常組織中CDH13mRNA 表達顯著增高，提示其表達減少或缺失可能與癌變有關。多項研究表明，CDH13 的再表達可抑制腫瘤的生長和侵襲[45]。通常CDH13 啟動子的甲基化常發生在癌癥病變的早期。相比肺鱗狀細胞癌，肺腺癌其甲基化率明顯增高[42]。

RUNX3 位于人類染色體1p36 上，該區域長期以來被認為是各種腫瘤中的抑癌基因。RUNX3 主要表達沉默和失活。在各種腫瘤相關文獻中報道了由于DNA 高甲基化導致RUNX3 失活，促進腫瘤細胞發展。包括肺癌等[46]。RUNX3 在肺癌中更頻繁地甲基化，并且RUNX3 甲基化發生在早期。

矮小同源盒2（short stature Homeobox 2，SHOX2）基因是抑癌基因，主要作用是修復DNA；SHOX2 高度異常甲基化使其抑癌功能沉默導致癌變[47-48]。2010 年，Schmidt 等[49]首次發現SHOX2 甲基化對鑒別肺部良惡性病變有這一定價值。在惡性肺結節組織，結節周圍淋巴結、支氣管灌洗液，胸腔積液及血漿中均檢測到SHOX2 甲基化呈高表達[50-53]。

前列腺素E 受體4( PTGER4)，該基因缺失、沉默和失活可抑制非小細胞肺癌的生長，其過度表達與非小細胞肺癌的生長和侵襲有關[54]，聯合SHOX2 基因檢測可提高惡性肺部病變的檢出率[55]。PTGER4 是前列腺素E2（PGE2）配體之一，前列腺素E2 是環氧合酶-2(Cyclooxygenase- 2，COX- 2)的生物活性產物，PGE2 可通過與PTGER4 配體結合來發揮生理功能，參與細胞增殖、組織侵襲、血管生成及凋亡等多種過程[56-57]，在許多實驗系統中指出COX-2 和PTGER4 在多種癌前病變和腫瘤組織中過度表達[55,58]，可導致預后不良[59]。PTGER4 的激活增加癌細胞侵襲能力[60]。

Weiss 等[55,61]發現 SHOX2 聯 合 PTGER4 基 因甲基化的檢測對鑒別SPN 良惡性有顯著作用。其曲線下面積（AUC）為0.88。靈敏度為90% 時，特異度為73%，特異度為90%時，靈敏度為67%，顯著優于傳統腫瘤標志物檢測。以上實驗研究表明，對聯合DNA 甲基化水平檢測結果分析，有較高的特異性，對惡性SPN的臨床診斷提供了可避免有創操作的檢驗方法。有相關研究表明，惡性肺部結節發生的不同時期伴隨著不同抑癌基因的甲基化[62]，故僅憑一種基因甲基化檢測結果對SPN 性質進行診斷尚不準確。隨著基因甲基化檢測技術的成熟，使甲基化檢測更穩定和更便宜，可以完善更多基因的甲基化檢測。綜上所述，DNA 甲基化可以作為有效診斷惡性肺部病變的新型標志物。

10 其他

分泌型磷脂酶A2-Ⅱa，肝細胞生長因子，血清蛋白質組生物學標志物片段，循環腫瘤細胞，p53 抗體[63-64]等均對惡性肺結節性質的評估有一定價值，但其預測肺結節良惡性的敏感性以及特異性較差，尚缺乏更多臨床的有效驗證。

11 總結及展望

惡性SPN 患者預后好與差，決定于早期對惡性SPN 的精確診斷。雖然外周血多基因甲基化聯合檢測在惡性SPN 無創診斷中的地位呈上升趨勢，但因各級醫院醫療條件有限，可進行該檢驗的患者仍處于少數范圍，基因甲基化缺乏實用性，以及對于非惡性SPN 患者基因異常甲基化的預后和通過手術切除惡性病灶后基因甲基化有無改變等的問題，仍然需要長期隨訪。隨著中國政治經濟的不斷發展，人們對健康的認識越來越全面，這種觀念不僅存在經濟富裕群眾中，而是面向全社會的人民群眾，大多因影像檢查發現較小SPN的患者是否進一步檢查（基因甲基化等），取決于就診當地醫院的醫療條件以及檢測價位?？蛇M一步建立包含臨床體征、外周血DNA 甲基化、影像學特征等對體積較小的SPN 良惡性評估更為精準的預測模型，進而對惡性SPN 進行預測，根據預測結果，選擇是隨訪觀察還是盡早手術切除等最佳的干預措施，盡量避免盲目有創手術及病理活檢等過度醫療，把握治療最佳時期。