液體活檢指導非小細胞肺癌治療的研究進展

周芳 ，潘小平

（1.內蒙古醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院，內蒙古 呼和浩特；2.內蒙古醫(yī)科大學，內蒙古 呼和浩特；3.內蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內蒙古 呼和浩特）

1 循環(huán)腫瘤細胞（CTC）的研究進展

循環(huán)腫瘤細胞[3]是來源于原發(fā)腫瘤或轉移腫瘤，獲得脫離基底膜的能力，并進入外周血液循環(huán)中的腫瘤細胞。它可以造成惡性腫瘤的術后復發(fā)以及遠處轉移,更嚴重即造成患者的死亡。外周血中CTC 的檢測對肺癌的早期診斷、疾病的監(jiān)測和預后評價具有非常重要的意義，具有作為指導肺癌個體化治療的預后生物標志物的巨大潛力。CTC 在血液中的含量非常少，每毫升血液中大約含有100 萬血細胞，但其中約含有的CTC 有1 個。因此若要有效地檢測其數(shù)量，則需要在外周血中對其進行富集。雖然在很久之前就開始了對CTCs 的研究, 但在各種惡性腫瘤中，它的潛在用途還沒有完全用于臨床的診療中。主要原因是循環(huán)血中CTCs 的含量非常少, 而就目前的檢測技術來說，CTCs的檢測還是非常困難，這也一直是CTCs 研究中的難以解決的問題[4]。

提取血液中的CTC 可以通過基于細胞直徑大小和其它生物物理特性的負性富集來進行分離，也可以通過使用CTC 表面的細胞標志物如上皮細胞黏附分子(EpCAM)進行正性富集來進行分離。但是目前仍舊缺乏能夠區(qū)分CTC 與非惡性上皮細胞的標記, 況且,由于腫瘤細胞直徑大小相差較大,基于細胞直徑的提取方法會導致大量CTC 的丟失。目前,在轉移性CRC患者中，分離和計數(shù)CTC 的平臺是CellSearch，它是唯一一個經(jīng)FDA 批準的,國際上最為穩(wěn)定和可靠的CTC檢測系統(tǒng)[5-10]。

CTC 與腫瘤的復發(fā)和轉移有關。CTC 分析為肺癌的預后評估和治療干預提供了實時“液體活組織檢查”的前景。外周血標本容易獲得且對人體的傷害較小，遂可重復采集。它們是常規(guī)臨床試驗的理想來源，被認為是“液體活檢標本”，而不是原發(fā)的腫瘤。但是，在臨床使用中，CTC 檢測仍存在著很多困難，如沒有特異性腫瘤標志物、沒有統(tǒng)一規(guī)范的檢測指標、無法取代傳統(tǒng)的影像學檢查、而且檢測費用相對高等。隨著CTC檢測方法的不斷更新，很多根據(jù)CTC 敏感性，以及特異性的無創(chuàng)CTC 檢測措施會得到進一步發(fā)展，為肺癌的診斷以及治療帶來新的檢測手段以及新的理論根據(jù)[11]。

2 循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA)的研究進展

腫瘤患者血液中的CfDNA 包括非腫瘤來源的DNA 和腫瘤來源的DNA, 后者又被稱為CtDNA, 它可以來源于凋亡的腫瘤細胞、活腫瘤細胞和CTCs。其基因圖譜與相應腫瘤的基因圖譜非常匹配,能夠真實可靠的反映患者的腫瘤信息[12]。在CfDNA 中，非腫瘤來源DNA 濃度較高,而CtDNA 的濃度很低[13]。根據(jù)過去的研究，我們發(fā)現(xiàn),如要完整地獲取腫瘤的信息，則需要滿足CtDNA 在CfDNA 的含量超過10%以上。目前認為[14],cfDNA 大部分是長度為150～200 個堿基對的雙鏈片段，它們進入血液的途徑是細胞凋亡和壞死。研究發(fā)現(xiàn),在健康人血漿中,正常細胞cfDNA 濃度約為30μg/L,而腫瘤患者則為180μg/L,且血漿中cfDNA會被很快地清除, 所以其半衰期很短。早在1977年,Leon 等就得出結論：癌癥患者cfDNA 總體水平較高，未患癌人群較低。

由于來自腫瘤的cfDNA 含量低、半衰期短,且不同癌癥患者之間個體差異大,因此需要超靈敏的方法來檢測血漿中的cfDNA。如今已有多種方法可以檢測血漿cfDNA 中的基因突變情況, 包括測序法、熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）、擴增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS)、突變富集PCR、變性高效液相色譜法以及數(shù)字PCR。然而,受到DNA 聚合酶錯誤率和測序反應的影響，這些方法的靈敏度和特異度較低。針對cfDNA，新一代測序(NGS)方法進行了很多改變,多項研究表明,NGS結合了深度測序覆蓋、分子條形碼方法和錯誤抑制算法的改良方法改進了檢測限,檢測的準確性和敏感性也隨之得到了很大的提高[15]。

3 循環(huán)腫瘤RNA 及外泌體的研究進展

分泌外泌體Exosomes[16-17]的各種來源有, 淋巴細胞、樹突狀細胞、肥大細胞及上皮樣細胞、腫瘤細胞等。囊泡類小體的直徑約為40～100 nm, 是由這些細胞分泌的，具有典型的脂質雙分子層膜結構，其攜帶有母細胞多種蛋白質、脂類、DNA 和RNA 等重要信息，在細胞和細胞間的物質交換和信息傳遞起到重要作用[18]。外泌體是一種30～150nm 的雙層膜囊泡，血液當中的很多細胞都可以釋放外泌體，例如：血細胞、內皮細胞、免疫細胞、血小板和平滑肌細胞等。外泌體中含有很多生物遺傳信息：蛋白質以及DNA、mRNA 和miRNA 等核酸，在細胞間進行信息交換和調節(jié)受體細胞活動。

外泌體含有大量的遺傳信息mRNA 和miRNA,miRNA 是具有功能活性的成分，也是外泌體中研究最多的成分。miRNA 是血液中含量最豐富的cfRNA 分子，許多物質可以攜帶miRNA，外泌體、凋亡小體、蛋白質-miRNA 復合物和腫瘤血小板就具有這一功能。最近的研究表明, 這些外泌體能夠用來檢測疾病的進展，是一種很有優(yōu)勢的標志物，甚至在病人出現(xiàn)臨床癥狀前做出腫瘤診斷、預后判斷、療效評估。腫瘤來源的Exosomes 促進腫瘤的生長, 轉移和耐藥。目前對于外泌體的分離提純方法包括高速離心法, 密度梯度離心法, 色譜法, 超濾膜過濾離心法等。在NSCLC 患者中，Exosomes 分泌的與腫瘤有關聯(lián)的蛋白有EGFR、KARS、claudins、RAB 家族蛋白等[19-20]。

NSCLC 外泌體的研究有重要的臨床意義, 但要投入臨床使用中還需大量研究。很多問題均可干擾外泌體的miRNA 的表達, 導致其特異性和靈敏性較差, 目前提純外泌體的方法還沒有完全找到, 外泌體的分離和純化過程還需要認真探索。在miRNA 的研究中，腫瘤組織和外泌體相差很大[21]，在臨床上還不能進行更多的使用。

4 小結

液體活檢是一種很有前途的微創(chuàng)檢測方法，可以檢測血液中的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）或循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）。盡管ctDNA 的存在是30 多年前首次被描述出來的，但對它的密集研發(fā)直到20 世紀10 年代才開始。

目前大量的研究正在尋找一種理想的方法:其足夠敏感、特異、可靠、可重復，可以用于早期診斷或預測肺癌的發(fā)展。盡管人們普遍熱衷于利用這一檢測方法達到目的，但目前還沒有證據(jù)支持臨床有效性以及液體活檢在肺癌早期診斷中的應用。綜上所訴，液體活檢作為無創(chuàng)的檢測手段，外周循環(huán)血中的CTCs、ctDNA、ctRNA 及外泌體可實時動態(tài)檢測腫瘤患者的病程，為非小細胞肺癌患者的分期、療效評價、預測預后、耐藥檢測及個體化治療提供了新的途徑。在效用和適用性方面，液體活檢不斷完善研究，改善問題，以最快的速度投入到臨床的應用中。但其在診療過程中也表現(xiàn)出很多的問題：一是分析前階段存在的難度，如血液中的生物標志物來說，血液采樣和分析階段之間的時間必須盡量縮短;所有患者最好可以在相同條件下進行檢測，才能達到更好的研究效果。二是在腫瘤體積非常小或者在胸部影像學上不可見的患者中，其血液中的生物標志物含量較低，這加大了檢測技術的難度和靈敏度。三是檢測癌癥特異性生物標志物，尤其是肺癌，雖然目前已經(jīng)取得了不錯的成效，但是針對分析前的處理和具體的分析步驟尚且沒有達到標準化，這也是當前在臨床實踐中將液體活檢用于癌癥早期診斷的一大難題。

由于需要很高的技術水平和費用，而且沒有統(tǒng)一規(guī)范的診斷標準，液體活檢真正用于非小細胞肺癌的臨床診療中，還有很長的路要走。需要進一步的探索來描述非小細胞肺癌中液體活檢各項指標的標準化、臨床驗證和基于成本的分析。隨著檢測技術的提升，檢測速度的加快，液體活檢技術可以加速向臨床發(fā)展，更加快速地實現(xiàn)精準醫(yī)療的夢想。