骨修復中細胞外基質調節固有免疫反應的研究進展

郭達，呂松岑

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院骨四科，黑龍江 哈爾濱 150086)

骨科疾病是一種常見疾病，可由骨科創傷、癌癥或先天性疾病等多種原因引起。自20世紀90年代初開始，骨組織工程一直致力于開發新的生物材料，以改善骨修復和再生。在各種生物材料中，細胞外基質(extracellular matrices，ECMs)被認為是制備骨再生移植物的最佳候選材料之一[1]。ECMs不僅能夠提供結構支持，還能提供多種生物分子，在骨修復過程中調節細胞的定植與募集[2]。多項研究表明，骨骼和免疫系統之間通過許多共同的細胞因子、分子通路以及轉錄因子相互作用，這些發現有助于界定所謂的骨免疫學領域，其中ECMs調節免疫信號已成為研究重點[3]。在這一背景下，目前的研究方向不是為了抑制免疫反應，而是通過構建ECMs衍生材料來調節骨免疫調節因子，誘導有利于骨修復的免疫反應[4]。因此，本文對固有免疫在骨修復中的作用、ECMs成分與固有免疫的關系、骨修復中富含內外源性免疫調節因子的ECMs對固有免疫的調節進行綜述，并對構建具有免疫調節性的ECMs進行展望。

1 固有免疫在骨修復中的作用

所有骨替代材料與其他外來結構一樣，在植入后都會引發宿主免疫反應，這是骨損傷后經典免疫反應的第一步。因此，了解骨損傷后的免疫反應是構建骨修復的免疫誘導材料的關鍵。

骨損傷后血管破裂會產生血腫，引發一系列急性炎癥反應，主要由中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞等免疫細胞參與，激活固有免疫應答[5]。多種血液和組織間液蛋白如凝血因子Ⅻ和組織因子吸附到損傷部位，激活凝血級聯和補體系統[6]。在這種情況下，活化的血小板產生凝血酶原激活物，激活凝血酶原并放大凝血過程。在凝血因子的催化下導致纖維蛋白形成，形成第一批募集免疫細胞的趨化蛋白基質。循環中的中性粒細胞很快被趨化蛋白基質募集到損傷部位。雖然它們可能導致纖維蛋白凝塊的形成，但其主要作用包括釋放蛋白水解酶、促進組織重建、并釋放炎性細胞因子[如白細胞介素(Interleukin，IL)-1β、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)、IL-8、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、巨噬細胞炎性蛋白-1β(macrophage inflammatory protein，MIP-1β)]和募集其他髓系細胞和間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)[4]。募集的單核細胞釋放更多的細胞因子并分化成巨噬細胞。據報道，單核細胞來源的巨噬細胞和組織駐留的巨噬細胞對骨形成有著重要作用[7]，而巨噬細胞能夠根據環境表現出不同的功能表型。最初，骨損傷后的急性炎癥反應使巨噬細胞向活化的M1表型極化，M1巨噬細胞釋放更多的炎性細胞因子，促進細胞募集并清除死亡細胞。在晚期，巨噬細胞向抗炎的M2表型極化，分泌組織修復因子[如IL-10、IL-1ra、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、血管內皮生長因子α(vascular endothelial growth factor α，VEGF α)]發揮抗炎作用，募集MSCs，促進血管生成誘導軟骨內骨形成[8]。募集到的MSCs在骨折部位附近分化成軟骨，進行軟骨內成骨，而直接膜內成骨則發生在骨膜下[9]。與此同時，它們還發揮著關鍵的旁分泌作用，釋放免疫抑制細胞因子抑制炎癥反應。其中骨髓MSCs通過多種途徑(包括Notch和PGE-2信號通路等)抑制固有免疫細胞的遷移、增殖和分化[10]。因此，骨髓MSCs與巨噬細胞之間的相互作用對骨修復至關重要。

根據這些原理，一些研究試圖通過調節巨噬細胞數量或其向M1、M2表型的極化來改善骨修復[11]。有報道稱，一些炎癥信號在骨損傷后的表達，可顯著促進骨修復。如，TNFα通過誘導骨祖細胞的募集或成骨細胞的活化促進膜內的骨修復[12]，而IL-1β則促進損傷后軟骨內骨形成。同樣，IL-6在炎癥過程中也有刺激骨形成的作用[13]。不同的研究表明，抗炎的M2表型巨噬細胞能夠促進MSCs的活動，并傳遞骨誘導信號促進骨修復[14]。越來越多的證據表明M1向M2表型的適當轉變有利于軟骨內成骨的骨修復[8]。然而，不同的細胞環境中信號分子會導致巨噬細胞向不同的表型極化。這在病理條件下尤為顯著，異常信號可能促使巨噬細胞向促纖維化表型轉變[15]。

2 ECMs成分與固有免疫

許多ECMs成分表現出重要的免疫調節特征，可以影響體內固有免疫應答。例如，膠原纖維是骨組織ECMs的主要組成部分，它與蛋白多糖共同維持了骨組織ECMs的機械物理特性。然而，膠原纖維可與某些免疫細胞受體相互作用。例如，巨噬細胞可以通過其清道夫受體特異性地黏附在Ⅰ型膠原纖維[16]。此外，膠原纖維還可以影響巨噬細胞樣U937細胞系上金屬蛋白酶9的分泌[17]。透明質酸是天然組織來源ECMs中重要的糖胺聚糖之一，其分子量的不同使透明質酸發揮的免疫調節作用也不同。例如，完整的高分子量透明質酸具有顯著的抗炎作用，可誘導巨噬細胞產生IL-10，而受損的低分子量透明質酸可以促進巨噬細胞向炎性表型極化并刺激TNFα表達[18]。免疫細胞與透明質酸之間的相互作用似乎也是雙向的，因為單核細胞的激活也可以調節其與透明質酸的結合。硫酸肝素是另一種重要的糖胺聚糖，與ECMs蛋白結合形成蛋白多糖，可以與免疫系統相互作用，調節細胞黏附、免疫細胞因子活性和白細胞遷移[19]。

不僅天然組織來源ECMs成分能調節固有免疫，纖維蛋白作為一種合成ECMs的成分，也被證明具有調節巨噬細胞行為的功能。纖維蛋白原在凝血因子的催化下形成纖維蛋白，參與損傷后血凝塊的形成[20]。已有多項研究報道，纖維蛋白可根據其在基質中的濃度促進或抑制巨噬細胞的遷移，并抑制巨噬細胞向炎性表型極化[21]。而纖維蛋白降解產物在體外能夠通過單核細胞募集白細胞[22]，還能促進單核細胞分泌IL-1β、IL-6等炎性細胞因子。

綜上所述，ECMs分子組成決定其內在的免疫調節特性，因此，對ECMs成分的準確了解對于進一步開發具有免疫調節性的ECMs至關重要。

3 ECMs整合外源性免疫調節因子調控固有免疫

為了調節移植時的固有免疫反應，可直接將細胞因子導入移植物中。如在小鼠中，將IL-1R1/MyD88信號轉導抑制劑與纖維蛋白基質共價交聯，能夠拮抗IL-1β的促炎效應，使MSCs向骨細胞分化，促進骨再生[23]。

在骨修復過程中，免疫細胞因子依次傳遞，能夠使炎癥反應階段向抗炎反應階段轉變。據Spiller等[24]報道，將IFNγ吸附到支架上，并通過生物素-鏈霉親和素結合IL-4，能夠驅動巨噬細胞由M1到M2表型的極化。這些支架在體內植入后也能夠促進血管生成，進一步證明了它們的功能。另一項研究表明，在骨組織修復中，從納米涂層中釋放出的IL-4能夠促進巨噬細胞M1向M2型的轉變并能促進植入物的整合[25]。最近，Schlundt等[8]進一步證實了M2巨噬細胞在骨修復過程中誘導軟骨內成骨的重要性，在植入截骨模型之前，他們將IL-4和IL-13添加到膠原支架上，從而刺激了M2巨噬細胞的極化，促進了骨修復。

除了白細胞介素外，合成肽是ECMs調節固有免疫的另一種途徑。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspartic acid，RGD)三肽已被證明可以增強骨髓細胞對ECMs的黏附，并通過整合蛋白的作用誘導巨噬細胞向抗炎表型極化[26]。白細胞相關免疫球蛋白樣受體-1( leukocyte-associated-lg-like receotor 1，LAIR1)是在多個免疫細胞中表達的一種受體。有研究顯示，與LAIR1結合的合成肽可以抑制骨髓源性巨噬細胞釋放促炎細胞因子，而只在合成肽連接到支架表面時才能觀察到這種效應[27]。TP508是一種合成的23-氨基酸肽，能通過誘導炎癥介質釋放和血管生成促進大鼠股骨骨折模型的骨修復[28]。用這種材料制成的吸附纖維蛋白原或支架也能引起良好的免疫反應，并能改善大鼠骨缺損的成骨能力[29]。

目前有多種途徑將免疫調節因子導入ECMs來指導體內固有免疫應答，但是外源性免疫調節因子的傳遞仍有一些缺點，如基質穿透性差、擴散作用、酶降解、無法控制劑量等。此外，一些特定媒介在體內傳遞免疫調節因子引發免疫反應也被證明是無效的。因此，我們制定了不同的策略來控制其在時間及空間的傳遞。其中，通過3D多層系統和智能水凝膠的作用，細胞因子能夠在ECMs支架按照一定順序釋放[30]。仿生生物材料，如水凝膠，精準度也已經發展到了分子水平[31]。通過這些技術，可以設計具有免疫特性的ECMs直接靶向作用MSCs和免疫細胞，使其發揮生理作用并釋放免疫因子。

4 ECMs驅動宿主細胞合成內源性免疫調節因子調節固有免疫

為了使ECMs移植物激發更多的生理免疫反應，研究人員嘗試使用多種生物制劑來刺激宿主MSCs或免疫細胞來傳遞關鍵的免疫細胞因子并促進骨形成。巨噬細胞的募集對于清除壞死組織和調節骨修復中的炎癥反應是至關重要的。Kim等[32]使用鞘氨醇-1磷酸酯激動劑與富含血小板的血漿結合，依次誘導炎癥因子(TNFα)和抗炎因子[骨保護素(osteoprotegerin，OPG)、IL-10、TGF-β1]的分泌，以促進巨噬細胞的募集和骨修復。相反，在富含Ⅰ型膠原ECMs中加入高硫酸化透明質酸鈉會減少IL-1β、IL-8、IL-12和TNFα的分泌，同時增加巨噬細胞IL-10和CD163的表達[33]。

此外，無機化合物如摻雜鎂的磷酸鈣骨水泥，也能夠誘導固有免疫反應，調節巨噬細胞的活性，以促進骨生成和血管生成。該化合物抑制巨噬細胞中TNFα和IL-6的表達，同時上調TGF-β1的表達[34]。除了巨噬細胞的活化外，免疫調節因子也可以用來調節MSCs的行為。例如，RGD三肽和3D透明質酸水凝膠的結合可以影響MSCs整合蛋白的表達[35]。總之，這些研究試圖通過靶向調節內源性MSCs和免疫細胞來促進骨再生，從而為骨損傷后的修復提供關鍵的線索。

5 總結和展望

本文回顧了在骨修復背景下，ECMs與固有免疫系統之間的關系。然后重點討論了ECMs成分與固有免疫細胞之間的相互作用，最后討論了富免疫調節因子的ECMs對固有免疫的調節。固有免疫在骨損傷后的初始階段發揮重要作用，如促進免疫細胞募集，調節炎癥反應。然而，適應性免疫反應同樣參與這一調節來指導骨形成階段。許多研究試圖設計基于ECMs的材料來調節適應性免疫反應，特別是靶向T細胞[36]。

我們討論了不同的ECMs成分如何調節固有免疫應答。這些研究表明，ECMs的成分是進一步的免疫調節工程需要考慮的重要因素。然而，除了其化學特性外，ECMs的物理特性也可以在體內調節免疫反應[37]。因此，富含免疫調節因子的ECMs的應用應與所使用ECMs的物理和化學特性結合起來。人們提出了不同的方法來改善生長因子的時空傳遞，從而設計“智能”的ECMs。然而，在大多數情況下，它們只關注成骨因子和血管生成因子。未來的研究應致力于根據骨修復的自然階段協調地傳遞成骨因子、血管生成因子和免疫因子。

MSCs的基因操作也已成為一種替代方法，可以更好地控制成骨和血管生成因子在工程化ECMs中的劑量和時間傳遞，以改善骨修復過程。基因修飾的MSCs可促進骨祖細胞的分化，直接促進骨形成，也可間接促進宿主細胞募集。MSCs過度表達IL-4和IL-10被認為有望成為緩解慢性炎癥(如關節炎)和促進組織再生的工具[38]。然而，它們產生免疫誘導型ECMs的能力尚未被探索。此外，細胞系的發展可能是控制這些關鍵基因表達的一個重要因素[38]。在沒有病毒載體的情況下，有效地將候選基因導入細胞仍然是一個公開的挑戰。

近年來，在提高ECMs移植物質量和移植后的免疫原性方面取得重要進展。在ECMs工程中，免疫調節因子可通過在特定的細胞因子中傳遞或刺激宿主細胞內源性，合成其他因子以豐富生物材料。從這個角度來看，基因修飾的MSCs代表了一種控制免疫調節因子時空傳遞的選擇，用來設計具有免疫調節性的ECMs，從而更加有效地促進骨修復。