補(bǔ)腎解毒法對(duì)HBV感染免疫耐受期產(chǎn)婦臍帶血漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞中PI3K、mTOR、p70S6K、IFN-α表達(dá)的影響*

彭建平 楊雯珺 霍 燚

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病科 (長(zhǎng)沙， 410007) 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)

HBV是嗜肝細(xì)胞病毒，感染人體早期能躲避機(jī)體先天免疫系統(tǒng)，能負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，HBV不直接損傷肝細(xì)胞，而由免疫清除介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)損傷機(jī)體[1-3]。多數(shù)患者因肝臟慢性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肝臟慢性纖維化，逐漸發(fā)展為肝硬化、肝癌，因諸多嚴(yán)重并發(fā)癥而死亡，慢性HBV感染者也面臨乙型肝炎重癥化、肝細(xì)胞型肝癌的風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)前認(rèn)為慢性HBV感染者難以徹底清除HBV病毒，主要原因?yàn)榉€(wěn)定的cccDNA持續(xù)存在及機(jī)體免疫功能受損[1-4]。許多研究提示，HBV感染者機(jī)體免疫功能受損，不能有效清除HBV[1,2,5,6]。因此恢復(fù)機(jī)體免疫功能對(duì)治療HBV感染有重要意義。漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞(pDCs)是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，能產(chǎn)生體內(nèi)95%左右的Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)抗病毒，能激活NK細(xì)胞溶解被感染的細(xì)胞，并能提呈抗原激活特異性免疫系統(tǒng)，在抗病毒中起著重要作用[2,7,8]。目前主要認(rèn)為干擾素通過(guò)降解cccDNA、病毒mRNA，抑制病毒DNA及增強(qiáng)宿主對(duì)被感染的肝細(xì)胞的免疫反應(yīng)，清除病毒[3]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-p70核糖體S6蛋白激酶(p70S6k)是一條重要的細(xì)胞通路，參與許多重要的細(xì)胞生理功能，該途徑的異常能導(dǎo)致惡性腫瘤、代謝性疾病、病毒感染不能清除等[9-12]。Cao等[13]研究發(fā)現(xiàn)，pDC產(chǎn)生干擾素-(IFN-α)過(guò)程需要PI3K、mTOR、p70S6k的參與。我們前期研究發(fā)現(xiàn)HBV感染免疫耐受期產(chǎn)婦臍帶血pDCs中PI3K、mTOR、p70S6k mRNA、蛋白表達(dá)及IFN-α分泌較正常產(chǎn)婦明顯減少，可能是HBV感染者pDCs產(chǎn)生IFN減少導(dǎo)致HBV感染纏綿難愈的原因之一。本實(shí)驗(yàn)觀察補(bǔ)腎解毒法對(duì)HBV感染免疫耐受期產(chǎn)婦臍帶血pDCs中PI3K、mTOR、p70S6k及IFN-α表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院2017年8月至2020年1月產(chǎn)科住院部乙型肝炎免疫耐受期產(chǎn)婦10例，其診斷標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)《2015年慢性乙型肝炎診治指南》[14]。排除條件：①合并其他肝?。虎诤喜⒏斡不⒏伟┑?；③合并其他嚴(yán)重心肺腎腦疾??；④近半年內(nèi)有合并細(xì)菌感染及其他病毒感染證據(jù)；⑤合并免疫系統(tǒng)疾病或近半年內(nèi)接受免疫治療者。本研究方案經(jīng)由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(批號(hào)：AF/SC-07/02.0)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20只SD大鼠，雌雄各10只，體質(zhì)量140～160 g，SPF級(jí)，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，動(dòng)物合格證號(hào)1107272011001140。

1.2.2 主要藥物 本實(shí)驗(yàn)的補(bǔ)腎方為六味地黃丸，源自《小兒藥證直訣》，組成：熟地黃、山茱萸、山藥各12 g，澤瀉、茯苓、丹皮各9 g。解毒方為甘露消毒丹，源自《溫?zé)峤?jīng)緯》，組成：白蔻仁、石菖蒲、黃芩、連翹 、貝母、射干、藿香各 10 g，茵陳 15 g，滑石 30 g，薄荷 6 g。補(bǔ)腎解毒方由兩方相加。所有藥材均使用地道藥材，并通過(guò)醫(yī)院藥學(xué)專家的質(zhì)量鑒定。

1.2.3 主要試劑 淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)蠊?，PBS、RPMI-1640(Thermo公司)，Recombinant Human IL-3、Flt3-L(peprotech，catalog#:200-03、300-19)，BDCA-2-PE、CD123-FITC、BDA-4-APC及同型對(duì)照抗體(德國(guó)Miltenyi Biotec公司)，CpG ODN2216(5’-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3’，上海生物工程有限公司)，Trizol(ambion，15596026)，SYBR Green PCR試劑盒(KAPA Biosystems，KM4101)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA，639505)，DNaseⅠ(Fermentas，AM2295)，DEPC處理水(bioswamp,RN1680)，引物由武漢天一輝遠(yuǎn)有限公司合成，人IFN-α ELISA試劑盒(Bioswamp,HM10251)等。

1.2.4 主要器材 電泳儀(BIO-RAD，型號(hào)：mini protean 3 cell),酶標(biāo)儀(芬蘭 雷勃，MK3),干式恒溫器(杭州爽盛儀器，K30)，離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf，Centrifuge5424R),微量移液槍(美國(guó)Rainin PiPet-Lite，各種型號(hào))，水浴鍋(Leica，HI1210)，冰箱(中國(guó) Haier，BCD-196TMZL),全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(上海 天能，Tanon-5200),超凈工作臺(tái)(蘇州 凈化，SW-CJ-1D型)，PCR儀(杭州 柏恒，GE48527)，熒光定量PCR儀(Bio-Rad,CEX-Connect96),凝膠成像系統(tǒng)(北京 君意，JY045-3C),37℃恒溫培養(yǎng)箱(上海 一恒，LRH-150)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 臍帶血pDCs的培養(yǎng) 免疫耐受期乙型肝炎產(chǎn)婦臍帶血pDCs的具體培養(yǎng)與鑒定過(guò)程參考此前建立的實(shí)驗(yàn)方法[15]。

1.3.2 含藥血漿的制備 20只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分成4組，無(wú)藥物血漿組、補(bǔ)腎組、解毒組、補(bǔ)腎解毒組，藥物的制備及灌胃參考文獻(xiàn)要求及前期實(shí)驗(yàn)[16,17]。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使pDCs生存率最高的血漿濃度分別為10%補(bǔ)腎中劑量組、10%解毒小劑量組、10%補(bǔ)腎解毒中劑量組[1]。本實(shí)驗(yàn)制備補(bǔ)腎中劑量、解毒小劑量、補(bǔ)腎解毒中劑量的含藥血漿，按照人-動(dòng)物體表面積換算法計(jì)算，小劑量相當(dāng)于成人臨床用藥的6.562倍，以小劑量的5倍劑量為中劑量，灌胃大鼠，每次1 ml，連續(xù)灌胃3 d，末次給藥2 h后采血，離心，過(guò)濾細(xì)菌，分裝至EP管，存放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 含藥血漿干預(yù) 含藥血漿干預(yù)參考文獻(xiàn)要求及前期實(shí)驗(yàn)[16,17]。將培養(yǎng)至第7天的pDCs用含終濃度為2 μg/ml CpG ODN 2216 的完全培養(yǎng)基換液并調(diào)細(xì)胞濃度至2×105/ml，按照每孔90 μl鋪至96孔培養(yǎng)板中，分5組干預(yù)，補(bǔ)腎組加入10 μl補(bǔ)腎中劑量藥物血漿，解毒組加入10 μl解毒小劑量藥物血漿，補(bǔ)腎解毒組加入10 μl補(bǔ)腎解毒中劑量藥物血漿，無(wú)藥物血漿組加入10 μl無(wú)藥物血漿，空白組添加10 μl完全培養(yǎng)基，置于37℃飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，分別收集細(xì)胞及上清液，標(biāo)記，后續(xù)進(jìn)行相應(yīng)的mRNA、蛋白及IFN-α檢測(cè)。

1.3.4 各組pDCs中PI3K、mTOR、p70S6k mRNA的相對(duì)定量檢測(cè) 引物序列見(jiàn)表1。使用Trizol提取細(xì)胞中總RNA，經(jīng)DNase I消除RNA中的DNA，去除DNase I，使用Oligo(dT)按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求反轉(zhuǎn)錄出cDNA，在各樣本cDNA中加入相應(yīng)引物、SYBR Green Mix、DNA聚合酶、ddH2O等配制擴(kuò)增體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)量3次，根據(jù)軟件記錄的PCR擴(kuò)增過(guò)程的熒光信號(hào)，得到相應(yīng)的CT值，用2-△△CT公式計(jì)算得到目的基因的相對(duì)定量。

表1 引物序列表

1.3.5 各組pDCs中PI3K、mTOR、p70S6k 蛋白的檢測(cè) 配制Western Blot實(shí)驗(yàn)所需的溶液，制備分離膠及濃縮膠，用梳子制作上樣孔。用PBS洗滌細(xì)胞，使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液裂解細(xì)胞，將被裂解的細(xì)胞轉(zhuǎn)至EP管，加熱變性蛋白，離心備用。使用BCA試劑測(cè)量各樣本蛋白濃度。將蛋白及BCA試劑分別加入相應(yīng)上樣孔，在電泳液中電離，當(dāng)染料到達(dá)電泳膠底部時(shí)停止電泳，用電轉(zhuǎn)液電轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫2 h封閉蛋白膜，用加入PI3K、mTOR、p70S6K抗體室溫孵育1 h，加入HRP標(biāo)記得羊抗鼠IgG室溫孵育1h，PBST洗滌3次，在暗室用ECL發(fā)光液對(duì)蛋白膜進(jìn)行顯色，用儀器讀取蛋白條帶灰度值。

1.3.6 各組上清液中IFN-α的檢測(cè) 將各組細(xì)胞的上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行檢測(cè)，以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，IFN-α為縱坐標(biāo)，求出方程，再根據(jù)每個(gè)OD值計(jì)算出相應(yīng)的IFN-α濃度，乘相應(yīng)的稀釋倍數(shù)得到每個(gè)樣本的INF-濃度值。

2 結(jié)果

2.1 各組樣本pDCs中PI3K、mTOR、p70S6K mRNA表達(dá)情況見(jiàn)表2

表2 各組間HBV感染免疫耐受期產(chǎn)婦臍帶血pDCs PI3K、mTOR、p70S6K mRNA表達(dá)的比較

2.2 各組樣本pDCs中PI3K、mTOR、p70S6K 蛋白表達(dá)情況 見(jiàn)圖1、表3

圖1 各組標(biāo)本 PI3K、mTOR、p70S6K 蛋白表達(dá)圖

表3 各組間HBV感染免疫耐受期產(chǎn)婦臍帶血pDCs PI3K、mTOR、p70S6K 蛋白表達(dá)及IFN-α 的比較

3 討論

彭得倜等[18]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎解毒方能降低慢性HBV感染免疫耐受期患者的HBVDNA、HBeAg、HBsAg定量，并能提高機(jī)體免疫功能。我們研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎解毒法能促使HBV感染免疫耐受期產(chǎn)婦臍帶血pDCs中Toll樣受體9、干擾素調(diào)節(jié)因子7的表達(dá)及IFN-α分泌增加[1]。以上提示補(bǔ)腎解毒法能提高HBV感染者機(jī)體免疫功能。我們前期研究發(fā)現(xiàn)HBV感染免疫耐受期產(chǎn)婦臍帶血pDCs中PI3K、mTOR、p70S6k mRNA、蛋白表達(dá)及IFN-分泌較正常產(chǎn)婦明顯減少，可能是HBV感染者pDCs產(chǎn)生IFN減少導(dǎo)致HBV感染纏綿難愈的原因之一。補(bǔ)腎解毒法對(duì)HBV感染者pDCs PI3K、mTOR、p70S6k有何影響，目前國(guó)內(nèi)外少有研究。

HBV屬疫毒，根據(jù)HBV感染后發(fā)展過(guò)程的臨床表現(xiàn)，對(duì)應(yīng)中醫(yī)的“脅痛”“黃疸”“積聚”“臌脹”等疾病。內(nèi)經(jīng)有言，“正氣存內(nèi)，邪不可干” “邪之所湊，其氣必虛”，人體正氣充足時(shí)，不易感染邪氣，即使被感染，也能及時(shí)清除病邪，邪毒久留不去，因兼有正氣不足，治療當(dāng)不忘扶正。慢性乙型肝炎患者多為嬰幼兒期感染，此期人體形氣未充，正氣不足，或不能識(shí)別病毒，病毒潛伏纏綿不愈，損傷正氣，正虛無(wú)力驅(qū)邪外出，由此相互損益。正氣源于脾腎。疫毒內(nèi)客，化濕生熱，日久損及脾胃，水濕運(yùn)化失常，加重濕邪困阻，濕滯氣郁血瘀可化熱。治以扶正驅(qū)邪，補(bǔ)腎解毒。

本實(shí)驗(yàn)選用六味地黃丸合甘露消毒丹加減組成補(bǔ)腎解毒方。方中熟地黃填精益髓，滋補(bǔ)腎精，山茱萸補(bǔ)養(yǎng)肝腎，山藥補(bǔ)脾益腎，佐以澤瀉利濕泄?jié)幔档てで鍨a相火，茯苓健脾滲濕，滑石清熱利濕，茵陳清利濕熱退黃，黃芩清熱燥濕解毒，白蔻仁、石菖蒲、藿香行氣化濕，健脾和中，令氣暢濕行，連翹、薄荷、射干、貝母清熱解毒，透邪散結(jié)，共奏益腎健脾、利濕化濁、清熱解毒之功。

本實(shí)驗(yàn)以HBV感染免疫耐受期產(chǎn)婦臍帶血pDCs為研究對(duì)象，用補(bǔ)腎方及補(bǔ)腎解毒方含藥血漿干預(yù)后，PI3K、mTOR、p70S6k mRNA及蛋白表達(dá)增加，IFN-α升高，其中補(bǔ)腎解毒方的影響更明顯，表明補(bǔ)腎方及補(bǔ)腎解毒方能促進(jìn)HBV感染免疫耐受期產(chǎn)婦臍帶血pDCs中PI3K、mTOR、p70S6k mRNA及蛋白表達(dá)及IFN-α分泌，改善機(jī)體免疫功能，補(bǔ)腎解毒方效果優(yōu)于補(bǔ)腎方。

綜上所述，補(bǔ)腎解毒方能促進(jìn)HBV感染免疫耐受期產(chǎn)婦臍帶血pDCs中PI3K、mTOR、p70S6k mRNA及蛋白表達(dá)及IFN-α分泌，為臨床單用補(bǔ)腎解毒法或與IFN-α、核苷類似物聯(lián)用，通過(guò)免疫調(diào)節(jié)治療HBV感染者，提供了部分理論依據(jù)，同時(shí)也為進(jìn)一步研究HBV感染者pDCs的PI3K、mTOR、p70S6k等相關(guān)內(nèi)容，如研究IFN-α增效減毒的中醫(yī)輔助療法，提供了部分參考。