四逆軟肝方對人肝星狀細胞株LX-2增殖、凋亡和活化的影響*

劉近明 趙國榮 艾碧琛 何宜榮 梅 明 鄒俊駒 肖碧躍 尹周安 毛婭男

湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院(湖南 長沙， 410208)

肝纖維化是各種慢性肝病導(dǎo)致肝硬化的共同病理基礎(chǔ)和必經(jīng)之路，是對慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)[1,2]。肝纖維化以細胞外基質(zhì)的大量產(chǎn)生并異常沉積為主要特征。肝星狀細胞(HSC)在肝纖維化過程中起著關(guān)鍵的作用[3]，HSC的激活和增殖導(dǎo)致合成和分泌大量的膠原等細胞外基質(zhì)，使其合成和降解失衡，并在肝臟內(nèi)異常沉積，導(dǎo)致肝纖維化[4,5]。因此，抑制HSC的增殖及誘導(dǎo)凋亡已成為近年來國內(nèi)外研究、治療肝纖維化的重點課題。本研究在明確四逆軟肝方對肝纖維化有治療作用的基礎(chǔ)上[6,7]，通過體外細胞實驗觀察四逆軟肝方對HSC增殖、凋亡和活化的影響，探討其抗肝纖維化的機制及作用。

1 材料與方法

1.1 細胞的培養(yǎng) 人肝星狀細胞LX-2株(以下簡稱“LX-2細胞”)來源于上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司。用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基(以下簡稱“正常培養(yǎng)液”)(美國Gibco公司，批號：8118016)培養(yǎng)，放置37℃(含5%CO2)恒溫培養(yǎng)箱(NATURE公司，美國)，細胞貼壁長滿單層后，用0.25%胰酶(美國Hy Clone公司，批號為1881862、8117302)消化、傳代，選對數(shù)生長期細胞供試驗用。

1.2 實驗藥物的制備 四逆軟肝方(由茵陳、田基黃、川貝、桃仁、牡丹皮、煅牡蠣、西洋參、白芍、白術(shù)、茯苓等藥物組成)由湖南中醫(yī)藥大學(xué)三湘門診部提供。四逆軟肝方加純化水適量沖洗3次，煎煮前先浸泡30 min，先武火煎開，后文火煎煮30 min，共煎煮兩遍，合并兩次煎煮的藥液，雙層濾紙抽濾，后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至1 g/ml(每毫升藥液含生藥1 g)，高壓滅菌鍋中121℃滅菌30 min，分裝藥液并用0.22 μm微孔濾膜過濾后4℃或-20℃保存?zhèn)溆?。以上藥物濃度? g/ml(每毫升藥液含生藥1 g)，用10倍稀釋法分別稀釋成多個濃度，以此進行藥物濃度的篩選和后續(xù)試驗的開展。

1.3 細胞分組及藥物處理 將細胞隨機分為四逆軟肝方組和正常對照組；四逆軟肝方組用其相對應(yīng)濃度的藥物水提物培養(yǎng)，正常對照組用正常培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.4 細胞增殖和毒性試驗 在96孔培養(yǎng)板中按照5×103個/ml的細胞濃度進行鋪板，每孔100 μl。培養(yǎng)隔夜待細胞貼壁后，分別用正常培養(yǎng)液或含0.1、1、1.25、2.5、10和100 mg/ml的四逆軟肝方水提物培養(yǎng)液培養(yǎng)。48 h后，吸走細胞上清，按照10∶1的比例在正常培養(yǎng)基中加入CCK-8標記劑，按照每孔110 μl加至孔板中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。用全自動酶標儀在450 nm處測量OD值，并計算出細胞存活率，存活率=(觀察組OD值-空白組OD值)/(正常組OD值-空白組OD值)×100%。同樣，采用0.1、1、10和100 mg/ml的多劑量四逆軟肝方處理LX-2細胞48 h后，取細胞培養(yǎng)上清測定LDH(乳酸脫氫酶)的OD值，并通過標準曲線計算出各組LDH釋放量。

1.5 細胞凋亡分析 分別用正常培養(yǎng)液和1、2和4 mg/ml四逆軟肝方水提物培養(yǎng)液處理細胞48 h后，采用Annexin V-FITC/PI雙染法(LiankeBio，中國)檢測LX-2細胞凋亡。離心收集1×105個/ml細胞，用雙蒸水稀釋5×Binding buffer(結(jié)合緩沖液)為1×工作液，取500 μl 1×Binding buffer(結(jié)合緩沖液)重懸細胞。每管加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI。混勻后室溫避光孵育15 min。FITC或PI熒光強度用全自動細胞計數(shù)儀(Nexcelom Cellometer,美國)進行檢測分析并導(dǎo)出數(shù)據(jù)。

1.6 免疫熒光染色 用24孔板進行細胞培養(yǎng)，待細胞貼壁生長后，吸出原培養(yǎng)液，PBS洗滌3次。分別用正常培養(yǎng)液和1、2和4 mg/ml四逆軟肝方水提物培養(yǎng)液處理細胞48 h，再吸走培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，每次5 min。室溫下用4%多聚甲醛固定20 min。重復(fù)PBS洗滌步驟，在室溫下用細胞滲透液(0.5%Triton X-100，PBS稀釋，每孔400 μl)透膜15 min。吸走滲透液，重復(fù)洗滌步驟，室溫下用封閉液(5%牛血清白蛋白，PBS稀釋)封閉孵育30 min。重復(fù)洗滌步驟，用相應(yīng)的初級抗體(PBS稀釋，每孔50 μl)在4oC孵育過夜。重復(fù)洗滌步驟，加入二級抗體(Goat anti-rabbit IgG,PBS稀釋，每孔50 μl，按1∶200稀釋)在37oC中避光孵育1 h，然后用DAPI染色10 min，重復(fù)洗滌步驟，每孔加入一滴抗褪色劑固定液，將樣品密封，然后使用熒光顯微鏡(奧林巴斯，日本)進行熒光點定位拍照。

1.7 蛋白質(zhì)印跡分析 用RIPA裂解液(ComWin Biotech，中國)在冰上對正常培養(yǎng)液和1、2和4 mg/ml四逆軟肝方水提物培養(yǎng)液干預(yù)的各組細胞進行裂解30 min，提取細胞總蛋白，并用BCA蛋白測定試劑盒(LiankeBio，中國)進行蛋白定量，計算蛋白濃度后進行蛋白含量配平，按照4∶1比例加入蛋白上樣緩沖液，并用金屬浴進行蛋白變性10 min。然后，將蛋白質(zhì)樣品(50 μg)經(jīng)標準SDS-PAGE(LiankeBio，中國)處理后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Biosharp，中國)上，在含有5%(重量/體積)脫脂牛奶或5%BSA的Tris緩沖鹽水(TBS-T；0.1%吐溫-20)中封閉60 min，阻斷非特異性蛋白結(jié)合。然后孵育膜用5%BSA稀釋于TBST中的初級抗體于4oC過夜孵化。用TBS-T洗滌3次，每次10 min，再用次級抗體(Goat anti-rabbit IgG,PBS稀釋，按1∶1 000稀釋)(Proteintech，美國)在室溫下孵育3 h。TBS-T洗滌3次，每次10 min，使用Potent ECL底物試劑盒(LiankeBio，中國)用化學(xué)發(fā)光法檢測目標蛋白帶。這些圖像是在化學(xué)發(fā)光成像設(shè)備(Bio-Rad，美國)中獲取的，并且使用Image Lab軟件進行掃描密度測定。

2 結(jié)果

2.1 四逆軟肝方對LX-2細胞活性的影響 采用0.1、1、1.25、2.5、10和100 mg/ml的多劑量四逆軟肝方分別評價其對LX-2細胞的生長抑制作用。細胞存活率通過CCK-8分析進行定量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在四逆軟肝方治療48 h后均以劑量依賴的方式降低(圖1A)。正常培養(yǎng)液組作為陰性對照。與正常對照組相比，四逆軟肝方組的細胞存活率均顯著下降。采用0.1、1、10和100 mg/ml的多劑量四逆軟肝方處理HSC細胞48 h后測定了(乳酸脫氫酶)LDH，見圖1B。除了四逆軟肝方(100 mg/ml)組與對照組相比有顯著升高，其他四逆軟肝方組均無顯著升高。表明四逆軟肝方可抑制LX-2的細胞增殖，且100 mg/ml以下劑量對細胞毒性小。結(jié)合細胞存活率和細胞毒性，我們選擇3種不同濃度的四逆軟肝方(1、2和4 mg/ml)進行后續(xù)試驗。

圖1 四逆軟肝方作用下LX-2的細胞活力和毒性與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 四逆軟肝方對LX-細胞凋亡的作用 結(jié)果顯示，四逆軟肝方誘導(dǎo)LX-2細胞凋亡在早期和晚期細胞凋亡及總凋亡中呈劑量依賴性。與對照組相比，除了四逆軟肝方(1 mg/ml)組的早期凋亡率無顯著改變，其他各組均有顯著升高。見插頁彩圖2A、2B。凋亡蛋白執(zhí)行子Cleaved-caspase 3免疫熒光分析顯示，在2、4 mg/ml的濃度時，Cleaved-caspase 3蛋白的熒光強度均明顯升高(插頁彩圖2C)。

蛋白質(zhì)印跡分析顯示，在4 mg/ml的濃度時Bcl-2顯著降低，2、4 mg/ml濃度時Bax顯著上調(diào)。

2.3 四逆軟肝方對細胞外基質(zhì)降解的影響 免疫熒光試驗和進一步的Western blot分析顯示，2、4 mg/ml的四逆軟肝方可降低TIMP-1蛋白的表達 (插頁彩圖3A、圖4)。同時，TGF-β1的表達也相應(yīng)下調(diào) (插頁彩圖3B)。

Western blot檢測α-SMA(HSC活化標志性蛋白)、β-catenin的表達水平 ，結(jié)果顯示四逆軟肝方1、2 mg/ml濃度時，α-SMA蛋白明顯下調(diào)；2、4 mg/ml濃度時抑制TIMP-1、β-catenin蛋白的表達。四逆軟肝方可能通過β-catenin途徑抑制LX-2細胞活化，并降低活化后LX-2細胞中TIMP-1和TGF-β1蛋白的表達。見圖4。

圖4 四逆軟肝方作用下LX-2細胞TIMP-1、α-SMA和β-catenin表達的Western Blot 分析與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

肝纖維化是肝硬化和慢性肝衰竭發(fā)生的主要危險因素[8]。HSC的激活是這一過程的關(guān)鍵組成部分。因此，靶向星狀細胞是抗纖維化治療的主流[9]。針對HSC的治療干預(yù)可能包括下調(diào)星狀細胞活化、抑制HSC增殖、誘導(dǎo)HSC凋亡[10]。在本研究中，四逆軟肝方通過凋亡誘導(dǎo)對人肝星狀細胞LX-2株表現(xiàn)出明顯的抗增殖作用。進一步研究表明，四逆軟肝方能在體外通過下調(diào)TIMP-1、TGF-β1促進細胞外基質(zhì)降解并通過下調(diào)β-catenin和α-SMA蛋白使LX-2細胞失活。四逆軟肝方抑制LX-2細胞增殖，并通過上調(diào)Cleaved caspase-3、Bax的表達和下調(diào)Bcl-2的表達促進細胞凋亡。四逆軟肝方還能促進ECM的降解，抑制LX-2細胞的激活。在體外，四逆軟肝方可能促進纖維化的消融。

調(diào)節(jié)HSC凋亡的主要有Caspase 家族、Bcl-2 家族等通過各種凋亡信號途徑引起細胞凋亡。Bcl-2為凋亡抑制因子，Bax為凋亡促進因子，在線粒體凋亡途徑中起著重要的作用[11]。Bcl-2/Bax對細胞接受刺激后的存活有關(guān)鍵作用，比值升高，細胞存活率就高，反之比值降低，則細胞凋亡率高[12-14]。Caspase-3 是Caspase 家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一，在細胞凋亡發(fā)生過程中扮演了關(guān)鍵角色，Caspase-3 蛋白的表達與細胞凋亡呈正相關(guān)[15]。Caspase-3在正常情況下以酶原的形式存在，當細胞發(fā)生凋亡時，caspase-3被活化成為cleaved-caspase 3，發(fā)揮促進細胞凋亡的作用[16]。本研究結(jié)果提示，四逆軟肝方抗肝纖維化作用不僅僅是抑制LX-2細胞細胞增殖，更是通過促進LX-2細胞凋亡實現(xiàn)的。Nexcelom Cellometer細胞凋亡率檢測結(jié)果顯示，SNRG具有促進LX-2細胞凋亡的作用，并呈劑量依賴。

SNRG誘導(dǎo)LX-2細胞細胞凋亡的機制可能是通過上調(diào)Bax和cleaved-caspase 3蛋白，下調(diào)Bcl-2蛋白表達，降低Bcl-2 /Bax比例，從而通過Caspase依賴性和線粒體依賴性途徑誘導(dǎo)細胞凋亡誘導(dǎo)LX-2細胞凋亡。

肝星狀細胞的活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的重要組成部分。HSC通常是靜止的，但它們在肝臟損傷時被激活，變得增殖和成纖維，并隨后積累ECM[17,18]。HSC被多種細胞因子激活，TGF-β是最重要的促纖維化因子[19]?；罨腍SC是肝損傷中TGF-β的主要細胞來源。TGF-β促進HSC向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化，促進ECM蛋白的合成，抑制其降解。

近年來，越來越多的研究表明，β-catenin信號在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。Ge等[20]研究發(fā)現(xiàn)，與正常肝組織相比，肝纖維化程度越高，其肝組織中β-catenin表達水平越高，沉默β-catenin可抑制Ⅰ型、Ⅲ型膠原的分泌和肝星狀細胞增殖，介導(dǎo)細胞凋亡。對β-catenin 的調(diào)控有望成為抗肝纖維化治療的靶點和方向。我們的觀察表明，四逆軟肝方可明顯抑制LX-2細胞中α-SMA(HSC細胞活化標志性蛋白)、β-catenin和TGF-β蛋白的表達。提示四逆軟肝方可能通過β-catenin途徑抑制LX-2細胞的活化。

此外，TGF-β還影響基質(zhì)降解，其特點是對基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和TIMPs的混合作用。纖維化反映了MMPs和TIMPs介導(dǎo)的ECM產(chǎn)生和降解之間的平衡。根據(jù)Yoshiji[21]的說法，TIMP-1通過減少MMPs活性和抑制HSC凋亡，顯著減輕肝纖維化的自發(fā)分解。在體外，四逆軟肝方能顯著降低TIMP 1蛋白在LX-2細胞中的表達，并可能通過減少TIMP 1的表達間接改變凈基質(zhì)蛋白酶的活性，從而促進細胞外基質(zhì)的降解。此結(jié)果也與本課題組前期實驗結(jié)果一致[7]。

四逆軟肝方為趙國榮教授根據(jù)30多年的臨床經(jīng)驗，辨證與辨病相結(jié)合所創(chuàng)立的治療肝纖維化、肝硬化的方劑，主要以茵陳、田基黃、川貝、桃仁、牡丹皮、煅牡蠣、西洋參、白芍、白術(shù)、茯苓等藥物組成，能疏肝健脾，益氣活血，并輔以清熱祛濕。該方能從逆轉(zhuǎn)肝硬化、逆轉(zhuǎn)肝纖維化、逆轉(zhuǎn)肝硬化失代償期、逆轉(zhuǎn)肝功能不全4個方面對肝病不同階段起到良好的治療效果[6]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，四逆軟肝方可降低受損的人肝星狀細胞LX-2株 HA、PCIII、TIMP-1指標的表達，可能是其抗肝纖維化的部分作用機制[7]。