創傷性脊髓損傷后Notch 信號對相關神經細胞的調控作用

張勇，譚龍旺，朱偉，楊藝，喬旭

(1.陜西中醫藥大學，陜西 西安；2.陜西中醫藥大學附屬醫院，陜西 西安)

0 引言

創傷性脊髓損傷(traumatic spinal cord injury，TSCI)是指脊髓組織受到外來暴力后出現的一系列以脊髓實質被破壞、功能被抑制的一種中樞神經系統性疾病，其主要表現為受損節段平面以下肢體感覺、運動及反射出現障礙[1]。TSCI 的不可逆性以及其極高的致殘率，長期以來給家庭、社會乃至國家造成了沉重的負擔。TSCI 發生后，小膠質細胞可活化為M1、M2 兩種不同的細胞類型，其分別起著促炎、氧化和抗炎、修復的作用[2]。M1 型小膠質細胞分泌的炎癥因子、氧化產物可再次引起周圍健康神經組織的壞死，炎癥因子最終引起星形膠質細胞向A1 型活化，產生膠質瘢痕。膠質瘢痕因其組織的致密性可阻止各種理化因子的擴散，保護未受損的神經細胞，但恰恰也是這些致密的纖維組織阻礙了脊髓神經元的重新連接，這使得后期使用神經干細胞移植來修復脊髓往往很難達到理想的效果。隨著醫學研究的深入，TSCI 發生后相關信號通路的調控機制開始越來越被人們重視。通過文獻索引發現[2-7]，TSCI 發生后抑制Notch 信號通路可引起小膠質細胞偏向M2 型活化，并間接減少了A1 反應性星形膠質細胞的產生、同時也可誘導神經干細胞分化為神經元和少突膠質細胞，這為TSCI 的治療提供了新的思路。

1 Notch 信號通路概述

1.1 組成

Notch 信號通路在哺乳動物中由4 種受體(Notch1-4)和5 種配體(DLL1-4，Serrate 樣配體Jagged1-2)以及轉錄調節因子(RBP-Jκ)和下游靶基因組成[5,6,8,9]。

Notch 受體中Notch1 受體在細胞內結構域包含36 個EGF 重復，而Notch2 包含35 個，Notch3 包含34 個，Notch4包含29 個。Notch 受體是由兩條非共價相關的多肽鏈形成的單程跨膜蛋白，包括胞外域、跨膜域和胞內域3 個部分[8]。

Notch 配體是一種保守的I型跨膜蛋白，因為在果蠅和線 蟲 中 叫 做Delta、Serrate 和Lag-2，Notch 配 體 也 被 稱 為DSL(Delta/Serrate/Lag-2)蛋白[5,9]。

轉錄調節因子是一組DNA 結合蛋白，在哺乳動物、果蠅和線蟲中分別被叫做：CBF-1、Su(H)、Lag-1，被稱為CSL{CBF-1/Su(H)/Lag-1}蛋白[6]。

下游靶基因主要由bHLH 轉錄因子基因家族成員組成，分為抑制型基因和原神經基因兩類，其中原神經基因包括神經分化發育相關基因Mash-1、Math、Ngn1、2、NeuroD、Olig基因(Olig1、Olig2 和Olig3)[10-14]；抑制型以HES-1、HES-3 和HES-5 及HES 相關蛋白基因(HERP)[15]，以及具有促炎效應的NF-κB(nuclear transcription factor)[16]。有研究證實抑制型bHLH 基因表達抑制原神經基因[17]。

1.2 作用機制

Notch 信號通路的激活方式有兩種，分別為CSL 依賴信號途徑和CSL 非依賴信號途徑。

CSL 依賴信號途徑是經典的Notch 信號途徑，在Notch 受體與配體相結合后，腫瘤壞死因子-α 轉換酶(tumor necrosis factor-α converting enzyme，TACE) 被 激 活，將 受 體 切 割為2 個片段，N 端裂解產物在胞外區被配體表達細胞內吞，而C 端裂解產物( 跨膜區) 在γ- 分泌酶剪切下，釋放出具有核定位信號NICD(Notch 蛋白的活化形式)，隨后NICD 轉移至核內，與轉錄抑制因子RBP-Jκ 結合成為(NICD/RBPJκ) 復合體，招募核轉錄激活蛋白家族MAML(mastermindlike) 組成(NICD/RBP-Jκ/MAML) 共激活復合體，調節下游靶基因(HES-1、HES-3 和HES-5 等)，通過靶基因的表達來調控細胞的功能[18,19]。在沒有NICD 的情況下(Notch 受體與配體未結合)，RBP-Jκ 則招募阻遏復合物蛋白(SHARP)形成(RBP-Jκ/SHARP) 抑制復合物抑制Notch 下游基因的轉錄[20]。

CSL 非依賴信號途徑直接通過下游基因Deltex 調控Notch 信號的表達。其方式為Notch 受體胞內區上的ANK 重復結構與鋅指蛋白Deltex 結合，信號激活后直接與Grb2 作用，介導Ras-JNK 信號途徑[21]。

2 小膠質細胞的活化

小膠質細胞起源于骨髓造血干細胞，后分化為單核巨噬細胞，通過血液循環廣泛存在于大腦、脊髓等神經系統中，也有人認為早在在胚胎期和胎兒期小膠質祖細胞就通過血管外途徑定植于神經系統。作為中樞神經系統的常駐免疫細胞，小膠質細胞可以通過吞噬微生物來保護大腦免受感染，也正是它們在生理條件下識別、吞噬和消化凋亡神經元的能力，使其在神經系統的形成和完整性中發揮至關重要作用[22,23]。研究表明[16,24]Notch 信號通路相關蛋白同樣可在小膠質細胞中表達，在TSCI 發生后，缺氧條件激活了Notch 信號通路，其下游中具有促炎效應的NF-κB 基因(抑制型bHLH 基因)在小膠質細胞內發生了表達，小膠質細胞向M1 型活化，M2 型小膠質細胞的活化則可能由其他通路誘導?；罨蟮腗1 型小膠質細胞可以產生一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)，NO 可與ROS 反應產生多種活性氮類攻擊細胞膜上不飽和脂肪酸引起脂質的過氧化，這反應產生了兩種影響：一方面，細胞膜脂質過氧化造成 DNA 分解和線粒體呼吸功能障礙，最終引起局部細胞的衰退[25,26]。另一方面，細胞膜Na+-K+泵被破壞，破壞細胞滲透平衡，引起細胞內電解質紊亂，Ca+內流，最終引起細胞壞死和凋亡[27-29]。此外，NO 還參與了脫髓鞘改變[30]。M1 型小膠質細胞同時還參與了炎癥反應，它們分泌IL-12、IL-6、白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ-干擾素(TNF-γ)等大量促炎細胞因子對神經、血管產生毒性作用，進一步加重脊髓的損傷。M2 型小膠質細胞則具有抗炎和修復的作用，其主要通過誘導清除劑受體和基質降解酶來減少氧化反應和炎癥的發生，并且清除劑受體和基質降解酶也可增強其吞噬能力。與M1 型小膠質細胞相比M2 更具有血管生成潛力，M2 型小膠質細胞可產生血小板衍生生長因子(pdgf)、血管內皮生長因子(vegf)和成纖維細胞生長因子(fgf)來促進血管生成。在脊髓損傷后7d，以M2 型小膠質細胞活化占主導，反應達到峰值，28d 后M1 型小膠質細胞活化為主導達到第二個峰值[28,31]。這說明了TSCI 中M1 型小膠質細胞在損傷后期占主導地位，M2 型在損傷前期占主導作用[2,32,33]。

種莉[24]等發現在靜息條件下小膠質細胞不具有釋放炎性介質及氧自由基等毒害因子的作用，而通過缺氧誘導后的小膠質細胞會迅速發生活化，大量分泌分泌IL-6、白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等產物，且活化后的小膠質細胞內Notch1 胞內段N1ICD、Hes1、Hey1 表達明顯升高，更有趣的是在實驗中通過DAPT(γ-分泌酶抑制劑)阻斷NICD，抑制Notch 通路后，小膠質細胞內N1ICD、Hes1、Hey1 表達降低的同時細胞上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α 的分泌水平也降低。在同樣的方式下Wu[34]等用DAPT(γ-分泌酶抑制劑)阻斷Notch 途徑時，發現M1 型小膠質細胞標志物的表達水平降低，M2 型小膠質細胞標記物的表達水平升高。這表明通過阻斷NICD 的方式來抑制Notch 信號通路，可使得小膠質細胞的活化更偏向于M2 型。

3 Notch 信號通路對星形膠質細胞的作用

星形膠質細胞是腦、脊髓等中樞神經系統結構的重要組成部分，在傳統上被認為是穩定和營養神經系統的細胞，它們具有攝取和釋放興奮性神經遞質谷氨酸的能力，參與了突觸的傳遞。作為神經系統的結構和營養支持，星形膠質細胞能夠調節腦血流并釋放S100B 和腦源性神經營養因子(BDNF)以達到營養神經元的目的[34-36]。此外，還有研究發現星形膠質細胞還具有刺激神經元突觸的生成的能力，并在神經發育過程中促進突觸的密度，更有意思的是星形膠質細胞靠吞噬作用來修剪突觸[37,38]。

在TSCI 發生后星形膠質細胞會產生A1 型和A2 型兩種活化，其中A1 反應性星形膠質細胞由M1 型小膠質細胞所分泌得炎癥因子引起[38]。A2 反應性星形膠質細胞由缺血環境誘導生成，它能夠上調了許多神經營養因子，可促進中樞神經系統功能的恢復。星形膠質細胞A1 型活化后失去了營養神經元、促進突觸生長、吞噬突觸和髓鞘碎片的能力，相反它會產生一種有毒物質，迅速殺死神經元和成熟的少突膠質細胞，在急性中樞神經損傷中，軸突斷裂后導致視網膜神經節細胞死亡的不是并因為營養缺乏，而是A1 反應性星形膠質細胞毒素的釋放，但這種可溶性毒素唯獨對神經元和少突膠質細胞具有毒害性，對其他類型的中樞神經系統細胞卻沒有作用[38]。通過抗炎性細胞因子TGFβ 處理后，A1 反應性星形膠質細胞轉錄水平顯著降低，但對于體內是否還有別的信號介導生成A1 反應性星形膠質細胞，目前還不得而知[38]。但明確的是降低M1 型小膠質細胞的水平或者抑制炎性反應可減少A1 反應性星形膠質細胞的轉錄[39]，從前文中可知抑制Notch 信號通路可以制止小膠質細胞向M1 型活化，也意味著抑制Notch信號通路可間接性抑制星形膠質細胞向A1 型的活化。損傷后的膠質反應導致小膠質細胞、少突膠質細胞前體和星形膠質細胞向損傷部位聚集，許多受損區域的星形細胞往往會變得肥大，并釋放抑制性細胞外基質分子硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPGS)，共同形成了膠質瘢痕，抑制了神經元突觸的生長，且CSPGS 本身具有抑制損傷后神經再生的能力[40,41]。孫嘉鍇[39]等發現脊髓損傷后運用弱激光治療(low level laser therapy，LLLT)可下調M1 型小膠質細胞活化，減輕炎癥反應，同時也抑制了星形膠質細胞活化，降低硫酸軟骨素蛋白多糖(Chondroitinsulfate proteoglycans，CSPGS)的表達，且膠質瘢痕組織明顯減少，證明膠質瘢痕和炎癥反應具有相關性。也側面證明了通過抑制Notch 信號通路來下調M1 型小膠質細胞活化同樣可以抑制膠質瘢痕的產生。高楓[42]等發現姜黃素可下調Notch 信號通路中Notch1 和Hes1 表達水平，抑制了脊髓星形膠質細胞的凋亡，與此同時炎癥因子IL-6 和TNF-α含量也發生了減少。

綜上脊髓損傷的早期通過抑制Notch 信號通路，可抑制炎性反應、減少星形膠質細胞的死亡，同時可以抑制A1 反應性星形膠質細胞的產生，減少毒素的生成和膠質瘢痕的產生。

4 Notch 信號通路對NSCs 的增殖與分化

TSCI 發生后內源性神經干細胞(NSCs)會發生增殖分化為不同的亞型，如神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞，它們共同參與神經系統損傷后的修復，但在哺乳動物體內這種分化方式必須經分子水平調控才能實現[43]，而Notch 信號通路同樣參與了這一過程[44]。Notch 信號通路下游靶基因多為bHLH 轉錄因子基因家族成員，分為抑制型基因和原神經基因兩種，抑制型基因包括：HES-1、HES-3 和 HES-5 及 HES相關蛋白基因，抑制型基因表達時NSCs 會發生增殖同時具有向星形膠質細胞分化的能力[45-47]；原神經基因包括：Mash-1、Math、Ngn1、2、Neuro D、Olig1、Olig2[5,6,9,48,49]，其中Mash-1、Math、Ngn1、2、Neuro D 的表達引起NSCs 向神經元分化，Olig1、Olig2 的表達可以促進NSCs 向少突膠質細胞分化，且抑制型基因表達時可對原神經基因產生抑制作用[5-7,17]。在上文中我們知道抑制型基因的表達由NICD/RBP-Jκ/MAML共激活復合體來調節，因此當DAPT 作用于NSCs 后，NICD的產生受到限制，Notch 信號通路被抑制，抑制基因表達受限，原神經基因轉錄表達，NSCs 會分化為神經元和少突膠質細胞同時抑制了NSCs 的增殖和分化為星形膠質細胞的能力[50-54]。

Notch 信號通路并不是一直可以影響到NSCs 的增殖分化，在正常脊髓內環境中有一種額外的機制使Notch 信號保持靜止，如：對正常斑馬魚脊髓中阻斷NICD 來源5d 后，未見髓內神經元數量發生變化。這可能與Notch 信號通路本身特性有關，在沒有損傷或臨近細胞凋亡的情況下，Notch 就不會引起細胞的分化與增殖，這可能是Notch 信號通路的第三項選擇[55,56]。

5 小結

通過上文我們發現：抑制Notch 信號通路可降低M1 型小膠質細胞的活化水平，相反可以促進M2 型小膠質細胞的生成；M1 型小膠質細胞生成障礙可阻止星形膠質細胞的A1 型活化和膠質瘢痕的生成；Notch 信號通路受到抑制，NSCs 將會向神經元即少突膠質細胞分化；激活Notch 信號通路時，NSCs 增殖同時向星形膠質細胞分化。

因此在脊髓損傷的急性期可通過抑制Notch 信號通路來減輕炎癥反應以保護血管、神經，抑制膠質瘢痕生成，為神經元軸突的連接創造條件。對于橫斷性的脊髓損傷可在受損區域移植NSCs 并通過抑制Notch 信號通路的方式誘導NSCs分化為神經元及少突膠質細胞，促進神經發生。

慢性期：主要是激活Notch 信號通路為內源性NSCs 的增殖，星形膠質細胞的生成提供條件。

目前不足的是，脊髓損傷后對脊髓水腫的消除還缺少Notch 通路的研究，脊髓損傷后除了小膠質細胞，還有中性粒細胞、淋巴細胞參與機體炎性反應[57]，對Notch 信號通路限制炎癥反應的研究只是局限于小膠質細胞領域，更多關于Notch信號通路對脊髓損傷的作用及機制還待進一步研究。