THRSP 和S14R 促進脂質合成的作用機制

郝明碩，吳靜，張政，段汪鑫

（華北理工大學基礎醫學院，河北省慢性病重點實驗室，河北 唐山）

0 引言

早在1984 年，人們研究甲狀腺激素在脂肪組織中的反應時就發現了甲狀腺激素應答蛋白Spot14 (thyriod hormone responsive spot14, THRSP)[1]。THRSP 基因包含THRSPα 和THRSPβ 2 種亞型。THRSPα 包含2 個外顯子和一個內含子，外顯子1 含有整個編碼區和部分3'非翻譯區，外顯子2為3'非翻譯區，外顯子1 編碼完整的蛋白Spot14(或稱S14)，該蛋白是一種小分子量、酸性的細胞核內蛋白，正調控或負調控輔激活轉錄因子，在組織特異性脂類代謝調控中起到關鍵的作用。Thrsp 和 S14R 基因是碳水化合物反應元件結合蛋白（ChREBP） 的直接靶基因，通過啟動子區的糖反應元件（ChoRE）調節表達。二者既直接接受 肝 X 受體（LXRs）的調節，也可以通過 ChREBP 間接被 LXRs 調節。另外，Thrsp 和 S14R 基因都可以與乙酰輔酶A 羧化酶（ACC）結合，顯著增強該酶酶活，進而促進脂肪酸和甘油三酯的生成[2]。

1 脂肪合成的生化過程

肝組織、脂肪組織、小腸是甘油三脂合成（脂肪合成）的三大組織。肝臟能夠合成脂肪，但不能儲存脂肪。其合成的三酰甘油、磷脂、膽固醇和載脂蛋白組成的極低密度脂蛋白（VLDL）分泌進入血液后，三酰甘油被水解，產物被其他組織利用。豬體內的脂肪合成工作主要由脂肪組織來完成，脂肪組織既以葡萄糖作為原料合成脂肪，還主要攝取由肝組織和小腸合成的脂肪酸。小腸主要靠消化食物中的脂類，再由消化產物合成脂肪[3]。

甘油三脂是脂肪酸在細胞內的主要存在形態，一般并不游離存在。甘油三脂有兩種合成路徑，一是 α-磷酸甘油（甘油-3-磷酸）途徑，因為以甘油-3-磷酸為原料與脂酰-CoA反應而得名，肝和脂肪細胞主要由此方式合成。α-磷酸甘油即甘油-3-磷酸，來源有兩個：一是由糖酵解的產物磷酸二羥丙酮還原得到，二是脂肪分解代謝生成的甘油以及胃腸道從食物中吸收而來的甘油，再由甘油激酶催化生成 α-磷酸甘油。利用葡萄糖合成或組織攝取的脂肪酸，經脂酰 CoA 合成酶催化，與輔酶 A（HS-CoA）反應生成脂酰-CoA。脂酰-CoA與 α-磷酸甘油經由參與 α-磷酸甘油途徑的催化酶催化，最終生成三酰甘油。甘油三酯生成的另外一種途徑是甘油一酯途徑，小腸粘膜上皮細胞主要按此途徑生成甘油三酯。此途徑中，小腸粘膜上皮細胞吸收的甘油一酯與脂酰 CoA 反應，由甘油一酯轉酰基酶（MGAT）、甘油二酯轉酰基酶（DGAT）依次催化生成脂肪[4]。乙酰-CoA 本身不能夠穿越線粒體內膜進入細胞質參加合成反應，需借助檸檬酸-丙酮酸循環，通過兩次物質轉化從線粒體轉移細胞質中[5]。

2 THRSP 基因簡介

甲狀腺激素應答蛋白(THRSP)是1981 年seelig 等用體外轉錄產物進行雙向電泳來研究甲狀腺激素對大鼠肝臟基因表達的影響。從甲狀腺功能低下、正常和甲狀腺功能亢進三組動物中，發現了的19 個可被調節的蛋白點，Thrsp 是第14個點，因此也稱作甲狀腺激素應答點14 蛋白（spot14），簡稱S14，是一種核蛋白。Thrsp 基因在人類基因組定位于第11 號染色體，在雞定位于1 號染色體，在小鼠定位于第7 號染色體，而在大鼠定位于第1 號 染 色 體。三 個 物 種 的 Thrsp均由兩個外顯子組成，且編碼區僅位于第1 外顯子。三者核苷酸序列的同源性為65 % ～87 %，編碼區的同源性高達83%～93%，蛋白序列的同源性為 82% ～94%。Thrsp 基因編碼的產物為一種分子量為17kD 的酸性蛋白，與其同源基因 S14R (S14 related) 之間存在三個保守結構域。其中僅有羧基端的卷曲螺旋(coiled coil) 結構域是已知的，該結構有助于 Thrsp 形成多聚體[6]。

3 THRSP 基因的表達

Thrsp 在細胞漿和細胞核內均有表達。對于該基因在不同組織中的表達情況，在人(Homo sapiens)、大鼠(Rattus rvegicus)、豬和雞上的研究發現該基因主要在肝臟、腹脂和乳腺等脂肪生成組織內表達(Jump, Oppenheimer,1985)，與肥胖癥密切相關。在心、腦、脾、肺、腎、睪丸和垂體等非脂肪組織中THRSPα 基因的表達極低，且不被高糖飲食和甲狀腺激素誘導表達。也有研究結果表明，Thrsp 基因在其他哺乳動物中也高表達于脂肪組織、肝臟和乳腺組織等脂肪生成活躍組織，這與其功能有關。在研究Spot14α 基因多態性與雞生長和體組成性狀的相關性時，采用限制性片段長度多態性(restrictionfragment length polymorphism, RFLP) 檢測方法，發現該基因的A123C 和9 bp 的插入缺失兩處突變[7]。近幾年有研究發現，通過體外實驗敲低THRSP 導致了細胞的脂質合成降低，且敲除小鼠(Mus musculus) THRSP 基因導致其乳腺的脂質合成下降、乳汁甘油三酯含量減少，而肝臟的脂質合成反而增多，由此證明THRSP 可以促進脂質合成[8]。

4 Thrsp 的表達調控

實驗證明，甲狀腺激素(triiodothyro-nine，T3) 處理20分鐘后即可誘導肝臟Thrsp 的表達，并使其在 4 小時內表達升高16 倍。迅速的調節反應提示Thrsp 是甲狀腺激素受體(thyroid receptor，TR) 的直接靶基因。由此Thrsp 被廣泛用于研究T3 調節基因表達的機制。這項研究同時發現，促進脂質合成的高糖飲食也可顯著誘導肝臟 Thrsp mRNA 的表達[9]。甲狀腺激素的替代治療可恢復Thrsp 對蔗糖處理的快速反應性。上述各種刺激因素通過激活對應的受體(如甲狀腺激素受體TR)或轉錄因子，如糖反應元件結合蛋白(carbohydrate responsive element binding pro-tein，ChREBP) 和 甾 醇 調 節元件結合蛋白-1c(sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c)、糖反應元件(carbohydrate response element，ChoRE)和甾醇反應元件(sterol response element，SRE)，在轉錄水平調節 Thrsp 的表達。目前在家畜、家禽中關于Thrsp 基因的研究報道多集中在對其單核苷酸多態性，Thrsp 基因多態性與豬的背膘厚、牛肉的嫩度及系水力、鴨的肝臟率、雞的腹脂重和體重等具有明顯的關聯性[10]。在 Thrsp 的主效基因地位方面，研究者發現人和小鼠 Thrsp 基因的染色體區域與肥胖癥有關聯。除此之外，Thrsp 的研究主要是對其表達調控的研究，但是它調控某些基因表達的具體機制仍不清楚，對其分子結構、蛋白質結構、是否存在轉錄及轉錄后水平的化學修飾也尚無報道，其對脂肪合成的作用的更詳細機理以及其他功能有待進一步研究[11]。

5 Thrsp 促進脂質合成的作用機制

對Thrsp 結構域的預測，沒有發現跟數據庫中的已知蛋白有一樣的催化結構域，說明該蛋白并不具備直接催化功能，可能通過其他方式在脂肪合成中發揮作用。 Thrsp 基因在脂肪沉積中起著重要作用，通過調控脂肪合成相關基因表達發揮作用，可調控 ME，FASN，檸檬酸裂解酶等基因的表達。也可以與 ACC 結合而顯著提高 ACC 在生理濃度下的酶活，引起脂肪合成的增加。在胚胎和動物幼仔發育過程中，Thrsp 表達的改變也提示該蛋白與脂質合成密切相關[12]。參與其中的酶包括 ATP-檸檬酸裂解酶( ATP citrate lyase，ACL) 、脂肪酸合成酶 (fatty acid synthase，FAS) 、蘋果酸酶( malic enzyme，ME) 和肝型丙酮酸激酶( liver pyru-vate kinase，L-PK)[13]。此外，利用RNA 干擾技術(short inhibitory RNA，si RNA) 敲低乳腺癌細胞Thrsp 表達的研究也證明Thrsp 是脂質合成所必需的。敲除Thrsp 基因近端啟動子和全長編碼序列的純合敲除小鼠在胚胎早期死亡，而保留了前21 個氨基酸的Thrsp 基因敲除小鼠可以存活，且遺傳規律符合孟德爾定律。該現象可能是由于Thrsp 的同源基因，S14R 在肝臟起到代償作用。而在S14R 不表達的乳腺中，Thrsp 的缺失顯著影響脂質合成，使敲除母鼠乳汁中甘油三酯含量比野生型減少33%，并主要缺乏中鏈脂肪酸。該現象主要反映在敲除母鼠哺育的幼鼠體重明顯低于正常[14]。

6 Thrsp 的同源蛋白S14R 簡介

Thrsp(又稱S14)的同源蛋白S14R，最早由Berti 等(2004)發現，與中線蛋白1( midline1，Mid1) 結合，在胚胎發育過程中共同維持細胞骨架的穩定性。因此 S14R 又稱為 Mid1相 互 作 用 蛋 白1(Mid1 interacting protein，Mid1ip1)、以 及Mig12(Mid1-interacting G12-like protein)。S14R 基 因 在 人和哺乳動物均定位于X 染色體，與Thrsp 的蛋白序列同源性為36%。S14R 為22kD 的胞漿蛋白，與Thrsp 不同，S14R 具有廣泛的組織分布[15]。過表達S14R 可促進LXR 激動劑誘導的脂質合成和甘油三酯堆積，而S14R 敲除則削弱LXR 激動劑的誘導作用，說明S14R 介導了LXR 活化引起的肝臟脂質合成。在大鼠原代肝細胞中，用siRNA 敲低Thrsp 或S14R均能降低葡萄糖刺激的脂質合成，并且二者同時敲低可使脂質合成進一步降低。而Thrsp 和S14R 同時敲低后，再用腺病毒過表達其中任一種基因，均可使脂質合成恢復，說明Thrsp與S14R 促進脂質合成的作用存在重疊。在體實驗也證明，S14R 過表達促進肝臟脂質合成[16]。

7 脂肪合成過程中關鍵基因的表達與調控

在轉錄調控機制的研究中，目標基因與轉錄因子功能相關性是首先應該分析的內容。通過試驗選取的豬的肝臟、大網膜、背最長肌、腎周脂肪、背膘5 個脂肪合成活躍的組織部位，通過熒光定量PCR 檢測5 個部位ACACA 基因、Thrsp基因、ACSL1 基因在不同體重分組的mRNA 相對表達量，從mRNA 水平研究三個基因表達量的關系。乙酰輔酶A 羧化酶（ACC）在脂肪合成代謝和分解代謝中都具有十分重要的功能，它包含ACC-α 和ACC-β 兩種同工酶，二者分別由ACACA 基因和ACACB 基因編碼。ACSL1 基因表達量的高低，可在一定程度上反應細胞中脂肪酸含量的多少[17]。試驗通過5 個部位的基因mRNA 表達量的研究發現，ACACA、Thrsp 和ACSL1 基因在轉錄水平的表達趨勢具有一致性，在大網膜、背最長肌、腎周脂肪組織中均有顯著或極顯著的相關關系。有研究表明，Thrsp 可與其同源蛋白S14R 以同源二聚體或異源二聚體形式結合，再與ACC 結合，顯著提高ACC 的活性。本研究結果中，Thrsp 基因與ACACA 基因在mRNA 表達水平具一定的相關性，但是Thrsp 對ACC 是否在轉錄水平存在調控作用，還需要基因啟動子區的研究、轉錄因子結合位點的研究、DNA 和轉錄因子結合分析等一系列研究，才能確定詳細的轉錄調控機制。ACSL1 與ACACA、Thrsp 間存在較強的相關性，但它與二者是否存在調控關系，也需要進一步詳細研究[18]。

8 總結與展望

本文以脂肪合成的生化反應為基礎，用文獻挖掘的方法介紹了脂肪合成過程分子調控網絡，Thrsp 可與其同源蛋白S14R 以同源二聚體或異源二聚體形式結合，再與ACC 結合，顯著提高ACC 的活性。研究通過對ACACA、Thrsp、ACSL1基因mRNA 表達水平的相關性分析發現，在不同的組織部位，三個基因之間均表現出較強的相關性，其中ACACA 和Thrsp位于同一條代謝通路中，已有報道稱Thrsp 可以顯著提高ACC 的活性，但是二者是否存在轉錄水平的調控，還需要通過啟動子克隆、報告基因活性分析、轉錄因子結合位點的確定、DNA-轉錄因子結合分析等試驗進一步研究。目前尚未報道ACSL1 與Thrsp 或ACACA 之間存在調控關系，研究結果顯示，ACSL1 與Thrsp 基因在mRNA 表達水平表現出很強的相關性，可進一步研究以確定是否存在調控關系。