ctDNA 在結直腸癌診斷中的應用進展

于恒響 周黎明

（1. 四川大學華西基礎醫學與法醫學院，四川 成都 610041；2. 四川大學華西基礎醫學與法醫學院藥理學教研室，四川 成都 610041）

結直腸癌在世界范圍內是最為常見的腫瘤之一，根據2018年全球癌癥報告，結直腸癌新發病例占全部病例的6.1%，位居第四位[1]。在我國，報告顯示2015年中國結直腸癌發病人數和死亡人數均位居第五位[2]。研究顯示，結直腸癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的五年生存率分別為81.2%、71.7%、58.4%和14.4%[3]，然而由于發病隱匿，早期癥狀不明顯，盡管早期結直腸癌患者擁有較高的五年存活率，但只有30%-40%患者在結直腸癌早期被確診，60%-70%患者直到晚期時才能被確診[4]。因此，結直腸癌的早期篩查及診斷具有重要意義。然而報道顯示，在美國，2018年50歲至54歲人群篩查率僅為48%，55歲至64歲人群中的篩查率也只有68%[5]。目前，美國癌癥協會（American Cancer Society，ACS）建議50歲以上人群定期進行結直腸癌篩查，包括：每年進行一次糞便免疫化學試驗（Fecal immunochemical test，FIT），高靈敏度糞便隱血試驗（High sensitivity guaiac fecal occult blood test，HSgFOBT）每年一次，多靶點糞便DNA檢測（Multitarget stool DNA test，mtsDNA）每3年一次，結腸鏡檢查每10年一次，CT結腸造影（CT colonography，CTC）每5年一次，柔性乙狀結腸鏡檢查（Flexible sigmoidoscopy，FS）每5年一次[6]。然而這些檢查大多是侵入性的，具有有創性，無法進行長期檢測，患者依從性不佳，且由于腫瘤的異質性，單一組織樣本難以反映腫瘤的整體情況等缺點。除此之外，有研究表明與糞便標本相比78%患者更愿意提供血液樣本[7]。因此，目前越來越多的研究投入到尋找基于血液樣本的結直腸癌診斷方法，人們通常稱之為液體活檢（Liquid biopsy）。本文就ctDNA在結直腸癌診斷應用研究進展進行綜述。

1 ctDNA的生物學特性

血液中含有許多有潛力用作生物標記物的物質，包括蛋白質、外泌體、核小體、循環癌細胞和循環腫瘤DNA等[8]。其中，循環腫瘤DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）正逐漸受到人們關注。1948年，Mandel和Métais首次在人類血液中發現了非細胞游離核酸（Cell free DNA，cfDNA）[9]。cfDNA是在血液、糞便、尿液或唾液中均可發現的游離于細胞外的基因片段，它由核酸鏈組成，核酸鏈來源于多種細胞，包括但不限于腫瘤細胞。1989年，Stroun等通過比較DNA鏈的熱力學穩定性，首次證實腫瘤患者外周血中的一部分cfDNA來源于腫瘤細胞，稱之為ctDNA[10]。ctDNA是cfDNA中來源于腫瘤細胞的部分，由腫瘤凋亡、壞死，或循環腫瘤細胞裂解產生，但其具體機制尚不清楚[4]。Gasparello等用LoVo和LS174T兩種細胞系進行了體內和體外實驗，結果顯示在體外LoVo細胞系比LS174T細胞更有效地釋放ctDNA，而相反當這些腫瘤細胞作為異種移植物在小鼠體內生長時，LS174T 細胞系在血液中ctDNA含量更加豐富，且這種差別與“管家”因素無關，如細胞增殖，腫瘤異種移植物的生長，壞死或微血管密度。顯示在細胞和全身兩個方面存在有兩種不同的途徑影響ctDNA的釋放[11]。

ctDNA長度在166 bp左右[12]，半衰期從15分鐘到幾個小時不等，通常被腎臟、肝臟和脾臟迅速清除。淋巴系統和血液的各種生理過濾（清除、降解等）也決定了血液循環中ctDNA的數量[13]。不同類型腫瘤ctDNA檢出率不同，Bettegowda等報道結直腸癌、胃食管癌、胰腺癌和乳腺癌患者中ctDNA的檢出率分別為73%、57%、48%和50%；不同分期患者ctDNA檢出率也不同，有47%的Ⅰ期癌癥患者可檢出ctDNA，而 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期癌的ctDNA檢出率分別為 55%、69% 和82%[14]。ctDNA的特征在于存在癌癥相關的遺傳和表觀遺傳突變，例如點突變，基因組序列重排，拷貝數變異（Copy number variations，CNV），微衛星不穩定性（Microsatellite instability，MSI），雜合性缺失（Loss of heterozygosity，LOH）和DNA甲基化[15]。這些特征有助于將它們與剩余cfDNA片段區分開來，從而使ctDNA成為能夠用于早期診斷與篩查，監測疾病狀態、進展和復發的潛在生物標志物。

2 ctDNA在結直腸癌診斷應用

目前，已有多項研究闡釋了ctDNA作為生物標記物用于結直腸癌診斷的價值。Yu等研究發現結直腸癌患者血液中ctDNA含量高于健康人，患者ctDNA樣本與腫瘤組織樣本的KRAS和BRAF基因突變一致性為92%[16]。Yang等研究發現結直腸癌患者血液ctDNA濃度隨腫瘤大小增加而增加，I期與IV期患者之間ctDNA濃度具有顯著差異。ctDNA 的檢出率高于目前5種常用腫瘤生物標志物，包括癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）、甲胎蛋白（Alpha fetoprotein，AFP）、糖類抗原19-9（Carbohy drate antigen 19-9，CA19-9）、癌抗原125（Cancer antigen125，CA125）、癌抗原72-4（Cancerantigen72-4，CA72-4）[17]。Hsu等檢測了32例結直腸癌患者的ctDNA樣本和腫瘤組織樣本中的基因變異，發現他們之間的一致性很高（85%），且ctDNA水平的變化與腫瘤縮小顯著相關；與ctDNA下降<80%的患者相比，治療后ctDNA下降>80%的患者無進展生存期更長（HR，0.22）[18]。He等研究發現結直腸癌的分期、大小、浸潤深度與檢測靈敏度呈正相關，而不同部位的腫瘤間檢測靈敏度無差異。浸潤性結直腸癌比潰瘍性和突出性結直腸癌表現出更高的敏感性，而不同組織學類型之間的敏感性沒有差異。有遠處轉移的結直腸癌（M1）比無遠處轉移的結直腸癌有更高的敏感性，而有淋巴結轉移的結直腸癌（N1和N2）與無淋巴結轉移的結直腸癌相比無統計學意義[19]?？梢?，ctDNA檢測相比其它常用腫瘤生物標志物具有優勢，且能一定程度反應腫瘤負荷和腫瘤狀態，在結直腸癌早期診斷應用前景廣泛。

對ctDNA進行基因檢測亦能用于結直腸癌早期診斷。Luo等對1493名結直腸癌高危人群進行的一項前瞻性隊列研究，發現ctDNA甲基化標記cg10673833檢測確定21例結直腸癌患者中的19例，8例原位結直腸癌患者中的7例，敏感性為89.7%（95%CI，0.727～0.978），特異性為86.8%（95%CI，0.849～0.884），AUC為0.90（95%CI，0.885～0.942）；對晚期癌前病變的敏感性為33.3%（95%CI，0.231～0.449），遠高于無癌或晚期癌前病變的陽性率（12.1%；95%CI，0.101～0.139），有望成為一種有效的非侵入性的結直腸癌篩查工具[20]。Church等研究發現了ctDNA中 SEPT9基因甲基化檢測敏感度為48.2%（95%CI 32.4%～63.6%）；結直腸癌Ⅰ～Ⅳ期分別為35.0%、63.0%、46.0%和77.4%；特異性91.5%（95%CI 89.7%～93.1%），顯示其在結直腸癌篩查或診斷中的價值[21]。Cohen等人描述了一種多分析物試驗（Cancer Seek），通過評估循環中蛋白和ctDNA突變水平，檢測八種常見癌癥，包括結直腸癌；使用對總共16種不同癌癥基因中的多個突變的分析結合選定的蛋白質生物標志物，作者在43%的I期結直腸癌患者中檢測到ctDNA，而在II-III期檢測率為70%，特異性為99%[22]。Osumi等通過下一代測序（NGS）對血漿中結直腸癌常見的14種突變基因進行分析，發現血漿中突變基因頻率與腫瘤轉移（肝臟，淋巴結，轉移器官數），腫瘤標志物（CEA，CA19-9，LDH）和腫瘤直徑（最大值）顯著相關[23]。Ou等利用集成化綜合液滴數字檢測（Integrated comprehensive droplet digital detection，IC3D）數字PCR系統提出了一種新的液體活檢方法，該系統可大大提升ctDNA檢測靈敏度，比現有的商業液體活檢ddPCR和qPCR平臺高50-1000倍。目前，該團隊正在進行一項臨床研究評估IC3D ctDNA檢測對預測早期結直腸癌的微小殘留病變和復發的預后的意義[24]。

ctDNA也可用于結直腸癌復發的監測，Scholer等對27名結直腸癌患者進行了縱向追蹤，顯示所有復發患者術后均檢測到ctDNA（n=14），而非復發患者未檢測到ctDNA。另外利用ctDNA檢測復發，與CT相比，平均提前9.4個月[25]。Symonds等檢測了144名患者的ctDNA BCAT1/IKZF1基因甲基化突變和CEA水平，顯示甲基化ctDNA檢測對復發的敏感性為66.0%（95%CI，57.1%-69.3%），顯著高于CEA（31.9%；95%CI，22.8%-36.6%）；特異性無差異（ctDNA，97.9%；95%CI，93.2%-99.6%；CEA，96.4%；95%CI，91.4%-99.0%）[26]。Benesova等研究顯示在22名復發患者中，22例ctDNA檢測陽性（100%），而影像學檢測到16例陽性（73%），腫瘤標志物升高15例（68%）[27]。Tie等檢測了96例III期結腸癌患者的術后樣本，發現20例中可檢測到循環腫瘤DNA，并且與較低的無復發生存率相關（風險比，3.8；95%CI，2.4-21.0）[28]。Tarazona等同樣報道了在接受輔助化療的結直腸癌患者中，治療后檢測到ctDNA與復發相關（HR 10.02）[29]。

3 總結與展望

ctDNA檢測具有非侵入、特異性高、敏感性高、以及能夠全面反映腫瘤異質性等優點，在結直腸癌早期診斷中應用前景廣泛。在預測化療療效和臨床預后[30]，全面準確提供患者體內不同腫瘤的信息[31]，檢測腫瘤耐藥性[32]等方面亦具有使用價值。但ctDNA檢測仍存在成本高、技術復雜、不同方法的結果尚無固定標準、可靠性與穩定性無法確定，且ctDNA產生機制尚不清楚等問題[33,34]。 因此2018年美國臨床腫瘤學會（American Society of Clinical Oncology，ASCO）和美國病理學家學會（College of American Pathologists，CAP）的一篇聯合評論認為沒有臨床實用性的證據表明ctDNA檢測在早期癌癥，治療監測或殘留疾病檢測中的臨床有效性。除臨床試驗之外，沒有臨床有效性或臨床效用的證據表明ctDNA測定可用于癌癥篩查[35]。ctDNA在結直腸癌診斷的應用仍需要進一步研究。