血管內皮中KLF2的表觀遺傳修飾調控#

姚裕鋒黃紹剛林澤帆陳奕鈿李樅森陳嘉瑩曾小耘

（1. 汕頭大學醫學院臨床醫學專業本科生，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學醫學院化學教研室，廣東 汕頭515041）

血管內皮細胞（Vascular endothelial cell，VEC）是各種生理刺激的重要整合者和轉化者，參與眾多生理過程[1]。各種刺激可調節VEC表型，如層流誘發內皮一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS）和血栓調節蛋白（Thrombomodulin，TM）表達，使VEC有效抗血栓、抗黏附和抗炎[2]。相反，許多有害刺激如湍流、促炎細胞因子或晚期糖基化終產物[3]可能使VEC功能失調，最終降低eNOS表達，促進血管細胞粘附分子-1（Vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）轉錄，并表達VEC促凝表型[1]。Krüppel樣轉錄因子2（Krüppel-like factor 2，KLF2）作為Krüppel樣轉錄因子家族中的重要成員，參與VEC中多種基因的轉錄調節，從而發揮VEC抗血栓、抗炎和抗氧化等生理作用。對KLF2的研究，可為臨床上心血管藥物的開發提供重要的思路。現對KLF2的表觀遺傳修飾的調控機制予以綜述。

1 KLF2調控的結構基礎

KLF2可調節VEC中多種基因的轉錄活性，同時其轉錄活性也接受多個因子的調節。位點分析表明在KLF2保守的啟動子區域內存在肌細胞增強因子2（Myocyte enhancer factor 2，MEF2）的結合位點，后者為KLF2關鍵的正性轉錄因子[4]。IIa類組蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylases，HDACs）包括HDAC4/5/6/7/9/10，為MEF2轉錄活性的負性調節因子。表觀遺傳學中，組蛋白乙酰轉移酶可誘導KLF2組蛋白中賴氨酸的乙酰化，使核小體松弛，增強轉錄活性，而HDACs則可對抗這種過程[5]。IIa類HDACs N端結構域高度保守，可介導其與MEF2的結合，使MEF2去乙酰化，抑制MEF2的轉錄活性，在轉錄水平調節KLF2的表達[6,7]。IIa類HDACs N端絲氨酸殘基的磷酸化狀態是決定其細胞定位和與MEF2相互作用的關鍵因素，其磷酸化將導致MEF2的解離和核輸出，從而促進KLF2表達[5]。HDAC5還可直接與KLF2蛋白結合，降低其對靶基因的轉錄活性[8]。KLF2 mRNA的3’端非編碼區可與microRNA-92a（miR-92a）結合，后者促進KLF2 mRNA降解和抑制KLF2蛋白翻譯，在轉錄后水平調節KLF2的表達[9]。KLF2蛋白氨基端由轉錄激活和轉錄抑制結構域構成，其中轉錄抑制區能與含WW結構域的E3泛素連接酶（WW domain E3 ubiquitin ligase 1，WWP1）結合，介導KLF2的泛素化和蛋白酶降解途徑[10]；羧基端包含三個串聯的Cys2/His2鋅指結構序列，能與靶基因的GC盒或GACCC盒結合，激活或抑制其靶基因，進而調節VEC功能[11]。

2 KLF2的表觀遺傳修飾

表觀遺傳修飾是DNA-組蛋白復合物的可塑動態變化，其通過改變轉錄因子對染色質的結合能力來快速改變相關基因的轉錄活性。其機制主要包括DNA甲基化、染色質重塑、組蛋白共價修飾和非編碼RNA等[12]。血流動力學、炎癥、氧化應激等因素引起KLF2表觀遺傳修飾，使KLF2表達量發生變化，進而調節VEC各種生理效應。

2.1 血流動力學

血流動力學是引起KLF2表觀遺傳修飾的因素之一。血管中局部血流動力學改變會影響細胞代謝，并觸發VEC的表觀遺傳改變[13]。層流剪切應力可通過磷脂酰肌醇激酶（Phosphatidylinositol kinase，PI3K）/蛋白激酶B（Protein kinase B，AKT）依賴的染色質重建信號通路調節VEC 中KLF2 的表達，這主要通過增加核仁素的表達實現[14]。用PI3K特異性抑制劑LY294002預處理人臍靜脈內皮細胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）后，核仁素可在層流切應力下與p85（PI3K的修飾亞基）交互，使PI3K參與KLF2啟動子的機械活化；核仁素一方面可自身結合于KLF2啟動子并激活其表達，另一方面可與不均一核糖核蛋白D（Heterogeneous ribonucleoprotein-D，hnRNP-D）相互作用形成共激活復合物，進而與KLF2啟動子結合并促進其表達，hnRNP-D和p300/ CBP相關因子（p300/CBP-associating facto，PCAF）都依賴PI3K/AKT通路與KLF2啟動子結合，并可使其組蛋白H3、H4乙酰化，染色質結構變松弛，從而促進KLF2的表達[14]。這些發現表明層流剪切應力作用下的KLF2表觀遺傳修飾可能與PI3K/AKT通路有密切聯系。然而，關于該通路調節KLF2表達量的機制目前尚無定論。Johannes等人報道層流剪切應力使PI3K/AKT快速（15s）瞬時激活，長時間（>24h）的層流剪切應力將降低HUVECs中PI3K/AKT通路磷酸化水平，進而增強KLF2 mRNA的穩定性[15]；Ding等人則認為振蕩剪切應力通過激活PI3K/AKT通路，誘導IIa類HDACs與MEF2結合，使后者去乙酰化，下調KLF2表達量[8]。

此外，VEC可在層流剪切應力作用下釋放ATP，通過激活后者特異性P2X4受體，誘導鈣內流和細胞外信號調節激酶（Extracellular signal regulated protein kinase 5，ERK5）磷酸化，在已建立的ERK5/MEF2通路中調節KLF2表達[16]；而振蕩剪切應力可抑制ERK5/MEF2通路，使KLF2的表達下調[17]。層流剪切應力還可通過Ca2+和鈣調素依賴激酶依賴性途徑刺激VEC中IIa類HDACs的磷酸化和核輸出，誘導其和MEF2 的解離，增強MEF2 的轉錄活性，上調KLF2表達[5]。層流剪切應力還可解除HDAC5與KLF2蛋白的結合，提高KLF2轉錄活性，促進其靶基因eNOS的表達[8]。這些研究表明，HDAC5可能為VEC功能障礙的預防和動脈粥樣硬化、缺血性腦卒中等心血管疾病提供一個新的治療靶點。

一些研究則表明miR-92a在振蕩剪切應力對KLF2負性調節過程中的重要作用。振蕩剪切應力通過促進miR-92a的表達，使得更多的miR-92a在AGO蛋白質1（Argonaute-1， AGO1）的介導下，與KLF2 mRNA結合，組裝成小RNA誘導的沉默復合體，后者通過募集AGO2，降低KLF2 mRNA轉錄活性，從而抑制KLF2及其靶基因eNOS和TM的表達；而使用miR-92a抑制劑處理后，KLF2、eNOS和TM的表達量均增加[18]；且KLF2和KLF4的過表達可逆轉miR-92a的這種抑制作用[19]。這些結果表明，在引起動脈粥樣硬化的湍流作用力下，VEC功能的紊亂主要是由miR-92a上調所引起，但關于血流動力學調節miR-92a表達的機制仍需進一步研究。

2.2 炎癥

炎癥反應時淋巴細胞和單核-巨噬細胞可被激活并產生白細胞介素1β（Lnterleukin - 1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎癥介質，通過調節核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）和PI3K等通路，以及引起VEC內關鍵基因的表觀遺傳修飾，從而降低一氧化碳的合成和生理利用率，增加活性氧（Reactive oxygen species，ROS）等產物，造成血管收縮和細胞、組織損傷[20,21]。TNF-α可減弱層流剪切應力對KLF2表達量的增強效應[22]，這一過程需要p65參與，后者通過募集HDAC4和HDAC5并與其相互作用形成復合物，在HDAC4末端18個氨基酸序列的介導下與MEF2結合，抑制KLF2轉錄[22]。另一炎癥介質脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）通過增加甲基轉移酶的表達使KLF2下調，進而影響VEC功能[23]。此外，Sirt1的過表達減少了顆粒物（Particulate matter，PM2.5）導致的肺內VEC中KLF2表達量的降低幅度，其中機制可能涉及MEF2；KLF2表達量的上調降低了NF-κB活性，進而抑制了PM2.5引起的肺內炎癥和凝血反應[24]。

PI3K/AKT介導的KLF2調控具有減輕炎癥反應的作用。肺炎鏈球菌感染時，跨膜受體Toll樣受體2和胞漿核苷酸結合寡聚化結構域可識別病原菌，誘導PI3K的兩個亞基p55α和p58α磷酸化，激活PI3K通路，促進肺內VEC中KLF2表達，進而抑制NF-κB和IL-8，控制炎癥和防止炎癥失控所導致的器官衰竭[25]。此外，血管生成素1與其TEK酪氨酸激酶受體2結合后，通過增強PI3K/AKT通路活性，促進MEF2轉錄和KLF2表達，進而促進機體血管活動靜止，以此對抗血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）誘導的炎癥和血管生成反應；這一途徑中AKT與MEF2之間分子聯系的機制尚未清楚，可能跟轉錄共激活因子p300和PCAF與MEF2的結合有關[26]。因此，PI3K/AKT通路或許可作為抗炎藥開發的一種新方向。

2.3 氧化應激

VEC在受到刺激后會產生過氧化物（Hydrogen peroxide，H2O2），氧化低密度脂蛋白（Oxidation modifies LDL，ox-LDL），高半胱氨酸和高級糖基終產物（High glycemic end product，AGE）等物質，這些物質以較高濃度持續存在于血漿或組織中，并主要通過氧自由基的過氧化反應引起胞膜脂質的過氧化和蛋白質、核酸變性[27]。有研究發現氧化應激可通過表觀遺傳修飾調節多條信號通路和多個酶的活性，從而促進VEC凋亡[28]。表觀遺傳修飾還可通過影響氧化應激中ROS的產生與清除，以及氧化還原平衡調控通路中關鍵分子的表達，從多個方面參與機體氧化平衡系統的調控[29]。在糖尿病中，H2O2和AGE可通過誘導小泛素樣修飾物SUMO的E2連接酶和E3連接酶來促進ERK5泛素化，而ERK5的泛素化可降低自身轉錄活性，通過ERK5/MEF2通路降低KLF2的表達量[30]。同時，高血糖的長期刺激也可降低此通路的磷酸化水平，增加KLF2靶基因內皮素的表達，從而引起糖尿病血管的特征性改變[31]。

p66shc屬于SH2包含蛋白線粒體銜接子家族，是一種氧化還原酶，參與線粒體ROS生成和氧化信號翻譯。在H2O2或紫外線介導的氧化應激中，p66shc的ser36磷酸化將增加氧化應激敏感性[32]。研究發現血漿S-腺苷同型半胱氨酸濃度升高可降低DNA甲基轉移酶1（DNA methyl transferase-1，DNMT1）活性，造成VEC中p66shc啟動子低甲基化，引起p66shc介導的VEC氧化應激反應和功能障礙[27]。p66shc主要依賴于MEF2A，通過抑制ERK5/MEF2通路，或者促進核呼吸因子1與MEF2A啟動子結合，進而促進p66shc結合于KLF2啟動子，下調KLF2表達[33]。進一步研究報道LDL可通過上調p66shc，調控KLF2，但這不是其調控作用的主要途徑；LDL主要誘導DNMT1在轉錄水平修飾KLF2，同時將原先結合于KLF2啟動子的MEF2替換成由甲基CGP結合蛋白2和zeste同系物2組成的轉錄抑制復合物，從而抑制KLF2表達[34]。綜上所述，p66shc和KLF2可能有望成為氧化應激相關的心血管疾病治療靶點。

2.4 其他

WWP1可與KLF2蛋白結合，促進其泛素化和蛋白酶降解途徑[10]；腫瘤抑制因子FBW7可靶向促進KLF2蛋白的泛素化降解[35]。以上兩個研究提供了KLF2翻譯后水平調節的機制。此外，p53可與KLF2結合并募集IIa類HDACs結合于KLF2啟動子，使KLF2基因的組蛋白去乙酰化，染色質結構變緊密，降低KLF2的轉錄活性；敲除p53基因可增加KLF2表達[36]。內皮集落形成細胞中，VEGF可促進HDAC5磷酸化，上調KLF2表達[37]。

3 結論

綜上所述，KLF2的表觀遺傳修飾受多種因素影響，在KLF2的轉錄調節中發揮重要作用；作為轉錄因子，KLF2則通過調控靶基因的表達對VEC功能進行調節。作為VEC功能調控位點，KLF2有望成為心血管疾病的藥物治療靶點及藥物療效評估標準，為心血管藥物的開發提供新思路。然而，目前對KLF2的研究仍存在不足，以下問題仍需解決：①KLF2對VEC保護機制的研究大多為體外實驗，缺乏體內實驗，兩者最好相互補充和驗證，以解釋體內外實驗結果的差異；②共同刺激因素下，淋巴細胞、巨噬細胞中KLF2表達量的變化情況及調控機制，及其與VEC中KLF2轉錄活性變化的聯系仍需深入探究。