干枸杞漿果菌落總數(shù)測定結(jié)果的測量不確定度評(píng)價(jià)

高 陽， 劉 丹

歐陸食品檢測服務(wù)(大連)有限公司，遼寧 大連 116000

因?yàn)槭称钒踩珕栴}引發(fā)了一系列的疾病,人們便更加注重食品質(zhì)量,尋找質(zhì)檢合格的產(chǎn)品才能放心食用。然而食品檢驗(yàn)檢測中包含了諸多重要指標(biāo),但是最常見的檢驗(yàn)指標(biāo)是產(chǎn)品的菌落總數(shù)[1]。因?yàn)槭称吩谏a(chǎn)、加工和運(yùn)輸途中會(huì)受到一定程度的污染，而菌落總數(shù)的變化能很好的體現(xiàn)出食品最終質(zhì)量，成為判斷是否符合國家食品標(biāo)準(zhǔn)要求的重要指標(biāo)。

微生物檢測樣品具有不均一性，導(dǎo)致多次檢測的結(jié)果也具有分散性，從而引入了測量不確定度這一概念。在一個(gè)完整的測量結(jié)果報(bào)告中包含不確定度參數(shù)，表明結(jié)果在一定的置信區(qū)間內(nèi)是真實(shí)可靠的[2]。

因此，本文對樣品干枸杞漿果的菌落總數(shù)測量結(jié)果進(jìn)行了不確定評(píng)估，使結(jié)果更加準(zhǔn)確且完整，具有科學(xué)性、真實(shí)性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1儀器設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱：(37±1)℃；恒溫水浴鍋：(46±1)℃；電子天平：分度值0.1 g；均質(zhì)器；移液器；無菌培養(yǎng)皿：直徑90 mm。

1.1.2培養(yǎng)基與試劑

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基；0.1%蛋白胨鹽水(PSS)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1菌落總數(shù)檢測方法

按照國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 4833-1:2013 Microbiology of the food chain —Horizontal method for the enumeration of microorganisms —Part 1: Colony count at 30 ℃ by the pour plate technique規(guī)定的檢測程序進(jìn)行。

檢測過程為：

(1) 無菌稱取25 g干枸杞漿果樣品并加入225 mL PSS，置于無菌均質(zhì)袋內(nèi)均質(zhì)，用拍打式均質(zhì)器拍打2 min，充分混合制成10-1初始稀釋液。

(2) 用2 mL無菌吸管轉(zhuǎn)移1.0 mL 10-1稀釋溶液到9.0 mL無菌PSS，充分混合制得10-2稀釋溶液。

(3) 另取一支新的2 mL無菌吸管，重復(fù)上述(2)操作，獲得進(jìn)一步稀釋，本試驗(yàn)一直稀釋到10-5稀釋度。每稀釋一次即換用1支新的滅菌吸管。

(4) 取兩塊無菌平皿。用無菌吸管分別吸取 1 mL干枸杞漿果樣品的初始懸浮液(10-1稀釋度)加到每塊平皿中。

(5) 另取兩塊無菌平皿，用另一支無菌吸管，分別吸取 1 mL 10-2樣品稀釋液。

(6) 本試驗(yàn)選取后4個(gè)連續(xù)的十倍稀釋液接種到平皿中，以期獲得生長菌落數(shù)在10～300之間的平皿，以便計(jì)數(shù)。

(7) 每塊平皿倒入12 mL～15 mL冷卻到44 ℃～47 ℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂，從制備好初始懸浮液(如果是液體樣品為10-1稀釋液)向平皿內(nèi)傾倒瓊脂，時(shí)間不得超過45 min。

(8) 采用順時(shí)針逆時(shí)針各三圈、水平和左右方向各三次的方式，將接種液體與瓊脂混合均勻，平皿放置在涼的水平面上待凝固。

(9) 完全凝固后，若懷疑產(chǎn)品中的微生物在培養(yǎng)中會(huì)蔓延生長至培養(yǎng)基表面時(shí)，可需加入4 mL 44 ℃～47 ℃覆蓋培養(yǎng)基或平板計(jì)數(shù)瓊脂，覆蓋在先前平皿表面，待其凝固[3]。

(10) 將平皿倒置于 (30±1)℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)(72±3)h。

(11) 菌落計(jì)數(shù)：在規(guī)定的培養(yǎng)周期后，盡可能記錄平皿上菌落低于300的菌落數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告菌落總數(shù)。

1.2.2不確定度的試驗(yàn)方案

由操作人員A和操作人員B分別對10份干枸杞漿果樣品進(jìn)行菌落總數(shù)檢測試驗(yàn)，試驗(yàn)方案的描述如圖1。每個(gè)操作人員對每個(gè)樣品取一次試驗(yàn)的用量，制備初級(jí)稀釋液進(jìn)行一次檢驗(yàn)檢測。具體檢測方法按1.2.1菌落總數(shù)檢測方法進(jìn)行。

圖1 測算實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差的試驗(yàn)方案

2 結(jié)果與討論

2.1 測量不確定度評(píng)定

對兩名操作人員同一天檢測的10個(gè)干枸杞漿果樣品菌落總數(shù)結(jié)果進(jìn)行歸納分析，詳細(xì)數(shù)據(jù)見表1。

再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差見式(1-1)

表1 操作員A和操作員B的10個(gè)樣品計(jì)數(shù)結(jié)果

0.09(log10)CFU/g

(1-1)

式中：

yij——對數(shù)轉(zhuǎn)換值，單位為log10(CFU/g)或log10(CFU/mL)；

i——樣品的序號(hào)，i=1-n(n≥10)；

j——再現(xiàn)性條件的編號(hào)，j=A或j=B。

按照《測量不確定度表示導(dǎo)則》(GUM)的定義，擴(kuò)展不確定度U為合成不確定度uc(y)和包含因子k的乘積。取k值為2(置信水平95%)時(shí)，則

U=2uc(y)=2SR

(1-2)

因?yàn)樵佻F(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差SR為±0.09(log10)，包含因子為2的擴(kuò)展不確定度U即為0.09×2=0.18(log10)。

2.2 討論

2.2.1不確定度來源分析

依據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)ISO/TS 19036:2006 Microbiology of food and animal feeding stuffs Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations的要求，本次實(shí)驗(yàn)室采用整體法來評(píng)估菌落總數(shù)的測量不確定度(MU)。此方法是對經(jīng)過全部檢驗(yàn)檢測過程后所得的最終試驗(yàn)結(jié)果的可再現(xiàn)性計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，認(rèn)為對標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)性評(píng)估等同于合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。整體法一般忽略偏差，采用“黑匣子”系統(tǒng)，指出了在食品微生物檢驗(yàn)檢測過程中主要的不確定度來源[4]，如圖2列出的九種因素。

圖2 食品微生物學(xué)不確定度主要來源示意圖

2.2.2不確定度的應(yīng)用

微生物檢測中本身存在各種影響因素，使檢測結(jié)果為一個(gè)估計(jì)值，而不是準(zhǔn)確的數(shù)值。例如，表1中操作人員A的1號(hào)樣品結(jié)果為510 000 CFU/g，取對數(shù)后為5.71(log10)，那么檢測結(jié)果報(bào)告為：(5.71±0.18)log10=5.53 log10～5.89 log10，計(jì)算反對數(shù)結(jié)果為338 844 CFU/g～776 247 CFU/g。結(jié)果報(bào)告為338 844 CFU/g～776 247 CFU/g顯然比只報(bào)告為510 000 CFU/g更具有真實(shí)性。同理可得出表1中其他樣本結(jié)果。由此可見，在測量結(jié)果中添加不確定度可以提高檢測結(jié)果的科學(xué)性。

3 結(jié)論

本次試驗(yàn)干枸杞漿果樣品的菌落總數(shù)為(y±0.18) log10，其擴(kuò)展不確定度為0.18(log10)，其他樣品的菌落總數(shù)檢測結(jié)果可參考該結(jié)果。本次實(shí)驗(yàn)表明，在檢驗(yàn)檢測結(jié)果的報(bào)告中引入不確定度，可使本實(shí)驗(yàn)室的檢測結(jié)果更加真實(shí)和準(zhǔn)確。